[发明专利]鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物、探针及应用

说明书

本发明提供了一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物、探针及应用，包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物；和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的疫苗株探针及核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的野毒株探针。本发明引物探针构建的复合荧光定量PCR方法能快速、有效的鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株和疫苗株，具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点。

技术领域

本发明属于动物病原分子鉴别技术领域，具体涉及鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物、探针及应用。

背景技术

犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)引起的高度接触性传染病。犬科、猫科、鼬科等肉食兽感染后死亡率可达30％～80％，而雪貂感染后死亡率则高达100％。实验表明，CDV可对猴造成致死性感染。近年来，随着犬瘟热病例逐渐上升，对毛皮动物养殖业、野生动物保护业和宠物饲养业危害极大。CDV属于有囊膜的单股负链不分节段的RNA病毒，基因组编码6个结构蛋白分别为核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大转录蛋白(L)。H蛋白是CDV所有结构蛋白中变异率最高的。H蛋白与粘连蛋白、信号淋巴激活分子受体结合后，对CDV细胞噬性、跨种间传播和介导病毒感染这三方面具有显著影响。CDV H蛋白受体结合位点区单个氨基酸突变可改变宿主嗜性和病毒毒力，从而使CDV不断产生新毒株。第519位、第530位以及第549位氨基酸发生替换，可改变病毒的细胞噬性，造成CDV暴发，种间大量传播且防控异常困难。迄今为止，CDV可分为Asia1–4、Africa-1、North America1–5、Europe/South America-1、Wild Europe、South America2–4、Africa-2等19个基因型，广泛分布于全球几个大陆。根据CDV H基因序列的变异情况和各病毒株之间地域及年代的不同可将CDV基因型划分为野毒株和疫苗株。目前，Arctic和Asia-1、Asia-3为我国主要流行的基因型，其中最主要流行的是Asia-1。

近年来，随着犬瘟热病毒野毒株基因变异频繁，新基因型的病毒不断出现，而弱毒疫苗免疫动物暴发犬瘟热病例时有发生。研究报道某些弱毒疫苗株的残余毒力可能是易感动物暴发犬瘟热的原因。随着犬瘟热弱毒疫苗在易感动物中的广泛应用，在控制犬瘟热流行起着重要作用，但同时对CDV野毒感染的传统诊断方法和疫苗接种动物的鉴别诊断提出了重大挑战。CD的治愈率极低，早期病例可望治愈，中后期病例治愈困难，因此快速早期诊断CD极其重要。此外，部分由犬源细胞传代生产CDV弱毒疫苗株在易感幼龄动物和野生动物体内毒力返强的病例也时有发生。因此，建立一种快速敏感鉴别CDV野毒株和疫苗株的方法对于澄清疫苗接种动物暴发犬瘟热的原因具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于建立了一种新型的复合荧光定量PCR方法，用于鉴定和检测犬瘟热病毒的野毒株和疫苗株，以对CDV感染进行早期快速而准确的诊断，从而防止CD的蔓延以及为CDV宿主致病性的定量研究提供依据和理论基础。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物，包括引物P1和P2：

P1：CAAACGGTGGCTGAATGACAT；

P2：CCACTGCTATAGTACATACCTTGGCTT。

在本发明的另一方面，提供了鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的探针，用于鉴别疫苗株的探针为：CATATAGTTGGTTGTTTGGA；用于鉴别野毒株的探针为：CATATAGTTGGTTGTCTGGA。

进一步的，所述野毒株和疫苗株的探针5’端添加荧光基团，3’端添加淬灭基团。

优选的，疫苗株探针的荧光基团为FAM，野毒株探针的荧光基团为HEX，野毒株和疫苗株探针的淬灭基团均为MGB。