[发明专利]鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物、探针及应用

权利要求书

1.一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物探针组，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物；和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的疫苗株探针及核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的野毒株探针。

2.根据权利要求1所述的一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物探针组，其特征在于，所述野毒株和疫苗株的探针5’端添加荧光基团，3’端添加淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物探针组，疫苗株探针的荧光基团为FAM，野毒株探针的荧光基团为HEX，野毒株和疫苗株探针的淬灭基团为MGB。

4.一种用于鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物。

5.根据权利要求4所述的一种用于鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的探针。

6.一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测病毒株的总RNA；

2)以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA；

3)加入含有序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物及序列如SEQ ID NO.3～4所示的探针的PCR反应体系中反应；

4)根据扩增结果判定：

没有C_T值和典型扩增曲线的样品，视为无犬瘟热病毒；

弱毒疫苗株阳性：FAM通道C_T值≤35，且出现典型扩增曲线，HEX通道无扩增，视为存在犬瘟热弱毒疫苗株病毒；

野毒株阳性：HEX通道C_T值≤35，且出现典型扩增曲线，FAM通道无扩增，视为存在犬瘟热野毒株病毒；

混合阳性：FAM和HEX两个通道都复合C_T值≤35，且都出现典型扩增曲线，视为野毒株与弱毒疫苗株犬瘟热病毒混合阳性；

可疑：C_T值＞35，且出现典型的扩增曲线的样品建议重做，重做结果出现C_T值≤35和典型扩增曲线者视为阳性，否则为阴性。

7.根据权利要求6所述的一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的方法，其特征在于，步骤3)中PCR反应体系为：480 Probes Master 2×conc 10μL，如SEQ IDNO.1所示引物0.4μL，如SEQ ID NO.2所示引物0.4μL，如SEQ ID NO.3～4所示探针各0.1μL，H₂O PCR-grade 7μL，cDNA 2μL。

8.根据权利要求6所述的一种鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的方法，其特征在于，步骤3)中反应条件为：95℃预变性5min后，95℃10s，61℃30s循环38次，61℃采集荧光信号。

9.序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物或序列如SEQ ID NO.3～4所示的探针或权利要求4所述试剂盒在制备用于鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的试剂中的应用。