[发明专利]lmo2733作为靶点在制备检测、鉴别或诊断单增李斯特菌的试剂中的应用

说明书

本发明公开一种lmo2733作为靶点在制备检测、鉴别或诊断单增李斯特菌的试剂中的应用，属于致病微生物检测领域。本发明利用基因组数据库中的数据，采用比较基因组学的方法，挖掘到单增李斯特菌特异性基因靶点lmo2733，丰富单增李斯特菌检测靶标，并以lmo2733筛选稳定可靠的引物组合，包括PCR引物组和LAMP引物组，并分别建立稳定可靠的PCR和LAMP检测方法；PCR检测特异性、灵敏度良好，检测下限可达200pg；LAMP检测特异性、灵敏度良好，肉眼可视化的检测限可达2pg；满足了不同环境下的需求。

技术领域

本发明属于致病微生物检测领域，特别涉及一种lmo2733作为靶点在制备检测、鉴别或诊断单增李斯特菌的试剂中的应用。

背景技术

单增李斯特菌是一种人畜共患致病菌，常引起严重的食品安全问题，人类受感染后可造成脑膜炎、败血症、流产等症状，对老人、孕妇、儿童等免疫低下者会造成严重的后果，致死率达20％～30％。近几年随着我国饮食结构的变化，生食、快餐的大规模食用也会增加单增李斯特菌的爆发风险，因此对单增李斯特菌的检测十分必要。

核酸检测是一种稳定可靠的检测方法，已经大规模运用于致病微生物的检测领域。聚合酶链式反应(PCR)是最常用的一种方法，该方法稳定性好、特异性高，但需要仪器设备，无法在实验室外的环境开展。环介导等温扩增(LAMP)是一种在恒温条件下快速扩增的技术，该方法针对检测靶点序列设计4至6条特异性引物，可在65℃左右、60分钟完成扩增反应，反应过程中会产生大量焦磷酸根离子，该离子会与体系中的镁离子形成沉淀，导致镁离子浓度降低，羟基萘酚蓝(HNB)会随着体系中的镁离子浓度改变显示不同颜色，从而可以肉眼鉴别阴阳性结果。目前常用的单增李斯特菌检测靶点如hlyA、prfA、iap、16S等，亟待挖掘其他检测靶点基因，以满足不同环境下的需求。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种lmo2733作为靶点在制备检测、鉴别或诊断单增李斯特菌的试剂中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

lmo2733作为靶点在制备检测、鉴别或诊断单增李斯特菌的试剂中的应用。

优选的，所述的lmo2733来自单增李斯特菌，GenBank：NC_003210.1(2805440..2807398)。

一种用于检测单增李斯特菌的试剂，包含能够检测lmo2733的引物；

具体的，以PCR为基础的检测技术，是实验室条件下最常用的检测方法，该方法稳定性好，特异性好、通量高。为评估lmo2733靶点的可靠性，决定首先建立PCR检测体系。使用的PCR引物组包括：

上游引物F：5′-GCAGCATTGATCCAACAAATG-3′；

下游引物R：5′-CGTAGCGTACGAAGATATTCG-3′。

PCR反应体系及条件：

PCR反应的体系采用25μL反应体系，包括1.5U taq酶(无3′外切酶活性)，2.5μL10Xtaq酶Buffer，0.2mM的dNTP，2mM MgCl₂，各0.2μM的引物F和引物R，2μL的DNA模板，再用ddH₂O补齐到25μL。

反应条件为，95℃预变性3min；循环反应为95℃变性15s，53℃退火30s，72℃延伸110s，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。最后1.5％琼脂糖电泳20min。阳性样本会有1653bp的扩增条带。

在实际运用中，尤其是偏远地区和欠发展地区，常常没有复杂的实验室仪器设备，因此本发明在LAMP体系中加入HNB染料，可实现对检测结果的肉眼判断。所使用的LAMP引物组包括：