[发明专利]荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法

说明书

本发明提供一种荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法，所述增敏荧光定量PCR试剂盒包括引物，以及两条以上的荧光探针，其中所述两条以上的荧光探针均具有与PCR模板互补的结合位点，在每一轮PCR过程中，扩增的一个DNA分子对应多个荧光信号的产生，从而提高了对样本的检测灵敏度。

技术领域

本发明涉及荧光定量PCR技术领域，尤其涉及一种荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法。

背景技术

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)在各个领域具有广泛的应用前景：如产前诊断、疾病诊断、治疗和预后等。该技术是在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，并可结合相应的软件对产物进行定量分析，从而获得起始目的基因的初始浓度。能够满足此目的荧光化学物质包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异的引物或探针，常用的包括DNA结合染料如SYBR Green和Taq man探针。在目前的系统中，针对一个扩增靶标只设计一对特异性的引物和一条探针，扩增结果非常依赖探针的设计质量，比如当探针的结合效率不高时，可能会出现假阴性结果，由于收集荧光的仪器本身存在一定的检测下限，当目标DNA的含量处于仪器检测的临界值时，容易出现没有信号值或多次检测Ct值不稳定的情况，造成结果不易判读，例如在通过检测样本中是否存在循环肿瘤DNA(ctDNA)来检测癌症时，由于样本中的ctDNA的拷贝数可能非常少，如何利用有限的DNA分子就显得极为重要。因此，有必要发明一种增强荧光信号的PCR系统，提高样本的检测灵敏性。

发明内容

本发明实施例提供一种荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法，旨在改善样本的检测灵敏性低的问题。

为解决上述问题，第一方面，本申请提供一种荧光定量PCR试剂盒，包括引物，以及两条以上的荧光探针，其中所述两条以上的荧光探针均具有与PCR模板互补结合的结合位点。

在一些实施方式中，所述PCR模板为含两条互补或反向互补核苷酸链的双链DNA分子，所述两条以上的荧光探针互补结合于所述DNA分子中的同一条或不同的核苷酸链。

在一些实施方式中，所述PCR模板为单链DNA。在一些实施方式中，所述单链DNA为双链DNA经转化得到的两条不互补的核苷酸单链，所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对和第二引物对能够分别扩增所述两条不互补的核苷酸链生成互补链。

在一些实施方式中，所述两条以上的荧光探针互补结合于所述单链DNA或其互补链中的同一条或不同的核苷酸链。进一步的，所述两条不互补的核苷酸单链分别包括如SEQID NO.2所示的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

所述第一引物对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述第二引物对如SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示；

所述荧光探针包括如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的探针，其中，所述SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的荧光探针可以互补结合于SEQID NO.2所示的核苷酸序列或其互补链，所述SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的荧光探针可以互补结合于SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或其互补链。

在一些实施方式中，所述荧光探针为TaqMan探针，所述TaqMan探针的发光基团可以为FAM、HEX、JOE、VIC、TET、ROX、Texas-Red、CY5或CY3中的一种或多种；所述TaqMan探针的猝灭基团可以为TAMRA、BHQ、DABCYL、MGB或ECLIPSE中的一种或多种。

在一些实施例中，所述单链DNA可以由本领域已知的方法来获得，例如：亚硫酸氢盐转化法、氧化-亚硫酸盐转化法、蛋白或抗体富集法、限制性内切酶法或酶促反应法。其中，所述亚硫酸氢盐可以为重亚硫酸氢盐。