[发明专利]B细胞的大规模组合CAR转导和CRISPR基因编辑

说明书

本公开内容的实施方案涵盖用于产生工程化B细胞的方法和组合物。本公开内容涉及用于产生B细胞的大规模方法，所述B细胞可以使用CRISPR工程化以破坏一种或多种基因的表达并且还表达至少一种异源抗原受体。具体实施方案包括用于该方法的具体参数。

本申请要求2019年11月27日提交的美国临时专利申请序列号62/941,651的优先权，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开内容一般涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学领域。

背景技术

B细胞可大致分为效应细胞和调节细胞。效应B细胞是体液免疫的关键驱动因素，因为它们能够产生对病原体具有特异性的抗体。最近已显示调节性B细胞通过产生抗炎细胞因子(包括IL-10、IL-35和TGF-β)来控制多种疾病的炎症反应。这些B细胞亚群对免疫调节和体液免疫的重要影响使它们成为各种免疫疾病的有价值的细胞疗法候选者。因此，对改进的B细胞免疫治疗方法的需求尚未得到满足。B细胞离体扩增的挑战及其在培养中经历细胞凋亡的趋势是限制其治疗潜力的主要因素。创建具有卓越活力的成功扩增方案将为B细胞直接用于治疗或作为体外抗体生产的来源打开大门。此外，改造B细胞的策略可以进一步增加其在治疗中的效用。因此，对于改进的特别是使用B细胞的细胞免疫治疗方法存在未满足的需求。

发明内容

本公开内容的实施方案包括与未经如此工程化的B细胞相比增强经专门工程化以具有此类活性的B细胞的活力和持久性的方法和组合物。具体实施方案包括与未经如此工程化的B细胞相比减少经专门工程化以降低细胞凋亡的风险的B细胞的凋亡的方法和组合物。本公开内容的方法利用特定参数来改善B细胞的扩增并提高它们的功效以用作有需要的个体的疗法。

本公开内容的实施方案包括用于扩增B细胞的新型大规模方法(包括GMP级)，包括使用或不使用CAR转导和/或基因编辑，包括CRISPR基因编辑。本公开内容提供了表达一种或多种异源抗原受体和/或已被基因编辑以破坏B细胞中的一种或多种内源基因的工程化B细胞。在一些实施方案中，CAR转导的B细胞被工程化以破坏B细胞中一种或多种内源基因的表达，并且在其他实施方案中，具有破坏B细胞中一种或多种内源基因的表达的B细胞被转导或转染以表达一种或多种异源抗原受体。特定实施方案提供了大规模CRISPR/Cas9介导的原代CAR转导的B细胞的工程化策略。

在某些实施方案中，所述方法利用允许该方法大规模进行(包括用于工程化高达1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹个或更多个细胞)的特定参数，包括条件和/或试剂。在特定情况下，所述方法利用连续步骤，包括一个或多个扩增步骤，以及细胞修饰以增强B细胞的增殖，如下：(1)携带一种或多种异源抗原受体；(2)缺乏B细胞中一种或多种内源基因的表达或表达减少；和/或(3)表达一种或多种细胞因子基因。B细胞关于(1)、(2)和(3)的修饰可以以任何顺序进行。在一些情况下，(1)、(2)和(3)中的一项或多项是任选的并且可以不使用。在特定情况下，使用针对多个基因的CRISPR和指导RNA敲除或敲低一个或多个内源基因。产生所需B细胞的方法还包括该方法的特定步骤的特定持续时间，包括该方法的一个或多个特定步骤。