[发明专利]B细胞的大规模组合CAR转导和CRISPR基因编辑

权利要求书

1.一种产生工程化B细胞的体外方法，其包括以下步骤：

(a)刺激从外周血单核细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、永生化B细胞系、B细胞杂交瘤、骨髓和/或脐带血单核细胞获得的B细胞持续第一时间段，所述刺激包括暴露于一种或多种适当的细胞因子，从而产生经刺激的B细胞；

(b)用CD40配体转导所述经刺激的B细胞以产生CD40L阳性B细胞，并且数字地扩增所述CD40L阳性B细胞持续第二时间段；和

(c1)和(d1)或(c2)和(d2)之一：

(c1)向扩增的CD40L阳性B细胞递送有效量的Cas9或CpF1和一种或多种指导RNA，以破坏B细胞中一种或多种基因的表达，从而产生基因编辑的B细胞；和

(d1)用编码异源抗原受体的载体转导或转染(c1)的基因编辑的B细胞，以产生经修饰的基因编辑的B细胞；

或者

(c2)用编码异源抗原受体的载体转导或转染扩增的CD40L阳性B细胞，以产生经修饰的B细胞；和

(d2)向所述经修饰的B细胞递送有效量的Cas9或CpF1和一种或多种指导RNA，以破坏B细胞中一种或多种基因的表达，从而产生经修饰的基因编辑的B细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的基因编辑的B细胞由(c1)和(d1)的步骤产生。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的基因编辑的B细胞由(c2)和(d2)的步骤产生。

4.根据权利要求1所述的方法，其中(c1)和(d2)的步骤各自进一步被定义为两个或更多个递送步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其中第一递送步骤包括递送靶向一种或多种基因的指导RNA，以及第二递送步骤包括递送靶向一种或多种基因的指导RNA，所述第二递送步骤中的所述基因不同于所述第一递送步骤中的一种或多种基因。

6.根据权利要求5所述所述的方法，其中所述第一递送步骤和所述第二递送步骤之间的持续时间为至少约2天。

7.根据权利要求5所述所述的方法，其中所述第一递送步骤和所述第二递送步骤之间的持续时间为约2-3天。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第一时间段在约44-48小时之间。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第二时间段是转导后约4-5天。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中(b)的扩增在IL-4、IL-10、IL-21、IL-2、CpG、抗BCR或组合的存在下发生。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中(c1)或(d2)的步骤在IL-4和/或IL-21的存在下发生。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中递送步骤通过电穿孔进行。

13.根据权利要求12所述的方法，其中电穿孔使用约200,000个细胞至1x10⁹个B细胞。

14.根据权利要求12所述的方法，其中电穿孔使用约200,000至2,000,000个细胞。

15.根据权利要求12所述的方法，其中电穿孔使用约1,000,000至1x10⁹个B细胞。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中电穿孔步骤中指导RNA的浓度为3、4或5μM。