[发明专利]来自细菌嗜肺巴斯德杆菌的CAS9蛋白的用途

说明书

本发明描述了来自细菌嗜肺巴斯德杆菌(P.pneumotropica)的CRISPR‑Cas9系统的新型细菌核酸酶，以及所述核酸酶用于在DNA分子中产生严格特异性的双链切割的用途。所述核酸酶具有独特的性质，并且可以用于改变单细胞或多细胞生物体的细胞中的基因组DNA序列。本发明因此增加了可用CRISPR‑Cas9系统的普适性，使得能够使用不同的Cas9核酸酶变体，以在大量特异性位点中和/或在不同条件下，切割各种生物体中的基因组或质粒DNA。

技术领域

本发明涉及生物技术，具体而言涉及新型酶，CRISPR-Cas系统的Cas核酸酶，其用于切割DNA且编辑各种生物体的基因组。该技术将来可用于遗传性人疾病的基因治疗，以及用于编辑其它生物体的基因组。

背景技术

DNA序列修饰是当今生物技术领域的热点问题之一。编辑且修饰真核和原核生物体的基因组，以及在体外操纵DNA，需要在DNA序列中靶向引入双链断裂。

为了解决这个问题，目前使用下述技术：含有锌指型结构域的人工核酸酶系统、TALEN系统和细菌CRISPR-Cas系统。前两种技术需要用于识别特定DNA序列的核酸酶氨基酸序列的费力优化。相比之下，当就CRISPR-Cas系统而言时，识别DNA靶的结构不是蛋白质，而是短引导RNA。特定DNA靶的切割并不需要从头合成核酸酶或其基因，而是通过使用与靶序列互补的引导RNA来进行。它使得CRISPR Cas系统成为用于切割各种DNA序列的方便且高效的手段。该技术允许使用不同序列的引导RNA在几个区域处同时切割DNA。这种方法也用于同时修饰真核生物体中的若干基因。

就其性质而言，CRISPR-Cas系统是能够将断裂高度特异性地引入病毒遗传材料内的原核免疫系统(Mojica F. J. M.等人，Intervening sequences of regularly spacedprokaryotic repeats derive from foreign genetic elements //Journal ofmolecular evolution. – 2005. – 第60卷. – 第2期. –第174-182页)。缩写CRISPR-Cas代表“成簇规律间隔短回文重复和CRISPR相关基因”(Jansen R.等人，Identification ofgenes that are associated with DNA repeats in prokaryotes //Molecularmicrobiology. – 2002. – 第43卷. – 第6期. – 第1565-1575页)。所有CRISPR-Cas系统都由CRISPR盒和编码各种Cas蛋白的基因组成(Jansen R.等人，Molecular microbiology.– 2002. – 第43卷. – 第6期. – 第1565-1575页)。CRISPR盒由各自具有独特核苷酸序列的间隔区和重复的回文重复组成(Jansen R.等人，Molecular microbiology. – 2002. –第43卷. – 第6期. – 第1565-1575页)。CRISPR盒的转录随后为其加工导致引导crRNA的形成，所述引导crRNA连同Cas蛋白一起形成效应复合物(Brouns S. J. J.等人，SmallCRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes //Science. – 2008. – 第321卷. – 第5891期. – 第960-964页)。由于crRNA和称为前间隔序列的靶DNA位点之间的互补配对，Cas核酸酶识别DNA靶并且在其中高度特异性地引入断裂。