[发明专利]一种适用于微量样本的DNA样本制备方法

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种适用于微量样本的DNA样本制备方法，所述方法包括：1)将微量样本以液氮处理；2)将所述液氮处理后的样本升温后温育；3)将温育后的样本以水杨酸锂进行处理或者用磁珠进行纯化，获得所述微量样本的DNA样本。本发明的方法仅需低至1mg或10⁴个细胞的数量级即可提取所需测序建库足量的DNA，而且利用本发明的方法提取的DNA杂质较少，测序建库DNA投入量低至2ng。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体而言，本发明提供了一种适用于微量样本的DNA样本制备方法，特别是微量植物或藻类样本。

背景技术

微量植物和藻类由于样本量比较少，对其进行全基因组测序时获得足够的DNA样本是一个挑战。现有的植物全基因组建库测序通常需要首先利用CTAB等方法从植物组织中提取全基因组DNA，然后通过全基因鸟枪法打断和扩增DNA片段建立测序文库。CTAB法提取全基因组DNA通常需要至少100mg植物组织样本，因此需要微量植物或藻类较长时间的生长才可获得足够的样本。利用CTAB法提取全基因组DNA，植物样本需经过液氮研磨和酚氯仿提取，提取过程繁琐、操作复杂、耗时较长。而且，CTAB法使用的酚氯仿等有机溶剂会造成环境污染，甚至有可能危害实验人员健康，包括致癌风险。另外，CTAB法提取出来的DNA常含有较多杂质如蛋白残留、多糖的污染、酚类物质的污染(如DNA为褐色)等，而这些残留物质对后续PCR检测等下游实验有很大影响，CTAB法提取DNA后测序建库的DNA投入量至少在μg级。

因此，本领域中需要适用于微量植物或藻类样本的DNA制备方法。

发明内容

至少为了解决植物全基因组建库测序中通常使用的CTAB法不适合微量样本测序的问题，本发明提出了一种适用于微量样本的DNA制备新方法，所述方法特别适用于微量植物或藻类全基因组测序。

因此，本发明提供了一种适用于微量样本的DNA样本制备方法，所述方法包括：

1)将微量样本以液氮处理；

2)将所述液氮处理后的样本升温后温育；

3)将温育后的样本用水杨酸锂进行处理或者用磁珠进行纯化，获得所述微量样本的DNA样本。

在一个实施方案中，在3)中，在所述反应体系中水杨酸锂的浓度为1-4mM。

在一个实施方案中，水杨酸锂处理的时间为5-15分钟。

在一个实施方案中，在1)中，所述微量样本为微量植物样本或藻类样本。

在一个实施方案中，所述微量植物样本在以液氮处理之前用表面活性剂进行处理；优选地，所述表面活性剂为SDS或Triton X-100。

在一个实施方案中，在1)中，所述微量植物样本为打碎的植物组织。

在一个实施方案中，在1)中，所述微量样本的量少于100mg或10⁵个细胞；优选地，所述微量样本的量为少于10mg或2×10⁴个细胞；更优选地，为1-5mg或(0.8-1.5)×10⁴个细胞。

在一个实施方案中，在1)中，液氮处理时间为2-4分钟。

在一个实施方案中，在2)中，所述温育的温度为50-70℃。

在一个实施方案中，在2)中，所述温育的时间为5-10分钟。

在一个实施方案中，在3)中，所述磁珠为AmPure XP Beads磁珠。

在一个实施方案中，在3)中，磁珠纯化的步骤如下：将温育后的样本和磁珠轻轻吹打混匀数次，并在室温下孵育，然后置于磁力架上吸附，待液体澄清后弃去上清液；将磁珠以80％乙醇洗涤1-2遍，然后加入水溶解，静置后磁力架吸附取上清液。