[发明专利]一种通用型TRUCK-T细胞、其制备方法以及用途

说明书

本发明涉及一种制备通用型人类TRUCK‑T细胞的方法，包括:(i)通过基因编辑技术破坏所述人类TRUCK‑T细胞中：14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因组区域；和15号染色体第45003745位至第45003788位的B2M基因组区域；并且(ii)利用同源重组原理把CAR分子和外源细胞因子基因序列分别插入到TRAC和B2M切割位点，以利用T细胞自身的TRAC的启动子和NFAT进行表达。

技术领域

本发明涉及基于CAR-T技术的免疫治疗领域，具体涉及一种通用型TRUCK-T细胞(即，U-TRUCK-T细胞)。

背景技术

作为肿瘤免疫治疗的主要手段之一，CAR-T细胞治疗在白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤的治疗中展现出惊艳的治疗效果。目前全球CAR-T领先的几大巨头公司：诺华、Kite、Juno、Cellectis在靶点、共刺激区域、转染方式等方面设计各具特色，诺华CTL019即将成为全球首个上市的CAR-T产品。国内CAR-T治疗发展紧随美国，百花齐放，开展的CAR-T临床试验已上百项。

随着2017年两款针对CD19的CAR-T产品入市，CAR-T在血液肿瘤中的应用也得到了世界认可。但血液肿瘤病人只占肿瘤病人的23％，其余大多为实体肿瘤，而现如今实体瘤的治疗手段有限，甚至一些实体瘤没有靶向药及治疗手段。CAR-T在实体瘤上的应用也越来越广泛，目前有国内外针对实体瘤开展了近200多例临床，主要集中在黑色素瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌等高发性癌症。虽然CAR-T在实体瘤中应用取得了一定的进展，但肿瘤微环境仍为导致许多临床效果不理想的主要原因之一。因此如何让CAR-T细胞更好的作用于肿瘤病灶已到达抑制肿瘤，乃至消灭肿瘤是目前急待解决的问题。

介于CAR-T在治疗肿瘤中的广泛应用，结合基因编辑，在第三代CAR-T的基础上，引入外源细胞因子，将CAR-T改造为能够招募其他天然免疫细胞，增加杀伤性因子释放，降低肿瘤血管的生成，清除细胞外基质等作用第四代CAR-T细胞，即通用型TRUCK-T，用于难治复发性实体瘤的治疗。

由于CAR-T在实体瘤中有了广泛的应用，并取得了一定了疗效，但治疗效果不尽人意，使得CAR-T在治疗实体瘤方面受到限制。基于CAR-T在实体瘤治疗上无法达到血液瘤的治疗效果的因素研究，肿瘤微环境及CAR-T未能重复的进入实体瘤等因素为限制CAR-T在实体瘤中疗效的主要原因。针对以上主要因素，结合基因编辑，在第三代CAR-T的基础上，引入外源细胞因子，将CAR-T改造为能够招募其他天然免疫细胞、增加杀伤性因子释放、降低肿瘤血管的生成、清除细胞外基质等作用的第四代CAR-T细胞，即通用型TRUCK-T，用于难治复发性实体瘤的治疗。

根据现有技术报道，CAR-T临床研究大都采用二代CAR-T技术，而采用第四代CAR-T技术在临床上研究报道不多。传统的TRUCK-T制备的T细胞主要来源于患者自身，在洁净室(Good manufacture Practice，GMP)环境下经过体外分离T细胞、激活、CAR和细胞因子利用慢病毒随机插入基因组、培养扩增，最后经过质控回输回患者体内。由于患者自身条件的影响导致不适合采血或采血分离T细胞后扩增难的问题会随之而来。当患者病情危急，从T细胞的分离到CAR-T的回输，整个流程的等待时间也将是自体回输要面临的重大问题。这些问题给CAR-T技术的广泛应用带来了局限性，因此目前CAR-T细胞治疗的一个重要研究方向是如何使用一个健康献血者的T细胞制备大量的CAR-T细胞，满足患者的临床使用。这一技术的建立将极大降低CAR-T疗法的成本，可以更好的保证统一制备的细胞质量，而且患者在需要时可以马上得到CAR-T细胞进行治疗。