[发明专利]一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物、检测试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒LAMP‑CRISPR检测用组合物、检测试剂盒和检测方法，该组合物包括LAMP扩增引物、crRNA和ssDNA荧光报告探针。该试剂盒包括上述组合物，还包括用于LAMP扩增的LAMP反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和p72质粒模板，以及用于CRISPR Cas12a检测体系的LbCas12a、RNase抑制剂、CRISPR反应缓冲液。本发明采用LAMP方法与CRISPR相结合的技术，可高效、精准并且不需借助大型仪器达到检测结果可视化的目的，为ASFV的快速诊断提供了新的技术支持。本发明建立的LAMP‑CRISPR对ASFV抗原分子的检测具有较高的灵敏度，能够检测到单拷贝即7×10⁰copies/μL的质粒浓度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物、检测试剂盒和检测方法。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种感染家猪和各种野猪的急性、出血性、高度接触性的烈性传染病，又称非洲猪瘟疫或疣猪病。非洲猪瘟病毒可以感染不同年龄段的所有猪群，急性症状最为常见，3～10天致死，死亡率可以达到100％。该病的临床症状主要表现为发热、出血以及皮肤发绀，甚至出现血块。病理剖检后通常可见脾脏异常肿大和淤血，淋巴结、肝脏和肾脏出血，这些临床症状与经典猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病等很难区分，因此一般通过实验室手段进行非洲猪瘟的诊断和确诊。

目前非洲猪瘟尚且没有有效安全的商品化疫苗，国际上主要通过病原学和血清学方法进行非洲猪瘟的诊断。然而，该病对于我国来说是一种新发传染病，并且由于非洲猪瘟引起的临床病程较短、发病比较急，通常在病毒抗体产生以前，动物已经发病死亡。因此，我国非洲猪瘟的防控主要应用病原分子学检测方法。国际动物卫生组织(OIE)将传统PCR方法和实时荧光定量PCR作为ASFV检测的金标准。然而，这些检测方法需要大型的仪器设备、专业人员操作和耗时较长等缺点，限制了该方法在现场的即时检测。等温扩增方法如重组酶聚合酶扩增法(RPA)，环介导等温扩增法(LAMP)和交叉引物核酸恒温扩增技术(CPA)的应用避免了大型仪器设备的使用，同时等温扩增方法结合免疫层析条后可以在田间得到应用。但是，这些等温扩增方法的缺点是特异性和敏感性较低，因此，在非洲猪瘟病毒的检测中没有得到推广。

2020年诺贝尔化学奖获得者Jennifer Doudna近期基于CRISPR系统开发的被称作DETECTR的新方法能够实现灵敏而又准确的DNA检测。DETECTR检测依赖于Cas12a酶，一旦Cas12a通过一段CRISPR靶向RNA(crRNA)的引导靶向识别目的DNA序列后，它会变成一种DNA切碎机，将附近的任何单链DNA进行切割。基于CRISPR Cas12a的功能与分子信号枪相结合，研究人员已经在人类样品中发现两种致癌性的人类乳头瘤病毒(HPV)。在CRISPR Cas12a识别目的靶序列之前，首先需要对目的序列进行扩增富集，目前多数扩增手段使用RPA反应，因为RPA的最佳反应温度与Cas12a的最佳切割温度相近。但是，由于RPA反应所需的酶种类多，价格昂贵，很难能够实际应用到基层兽医的病原检测诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种避免采用RPA反应、能够推广到基层应用的非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用序列组合物、检测试剂盒和检测方法。本发明通过对LAMP的扩增方法与CRISPR Cas12的检测方法结合成为LAMP-CRISPR的分子检测试剂盒和检测方法。该分子检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性，操作简便快捷，成本低廉，不需要大型仪器设备，具有可视化的优势，更有利于对ASFV的分子检测技术在基层中的推广和应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物，包括LAMP扩增引物、crRNA和ssDNA探针；

LAMP扩增引物由内引物和外引物组成：

外引物：