[发明专利]一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物、检测试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物，其特征在于，包括LAMP扩增引物、crRNA和ssDNA探针；

LAMP扩增引物由内引物和外引物组成：

外引物：

2F3：5’-CTATAAACATATATTCAATGGGCC-3’；

2B3：5’-GCAATATACGCTTTAAACCATG-3’；

内引物：

2FIP：5’-ACGTGTCCATAAAACGCAGGTTTTTCAGACATTAGTTTTTCAT

CGTG-3’；

2BIP：5’-AGGTTGTGTATTTCAGGGGTTACTTTTTCATTAATGAAATCTCG

CTCAC-3’；

crRNA：AAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUCGUGGUGGUUAUUGUUGGUGU；

ssDNA探针：FAM:5’-(FAM)CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG(BHQ1)-3’。

2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物，其特征在于，LAMP扩增引物中内引物和外引物浓度比为12 pmol/μL:2pmol/μL。

3.一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～2任一项所述的组合物。

4.根据权利要求3所述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于LAMP扩增的LAMP反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和荧光试剂，以及用于CRISPR Cas12a 检测体系的CRISPR反应缓冲液、LbCas12a和RNase抑制剂。

5.根据权利要求4所述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应缓冲液由40 mM Tris-HCl，pH 8.8、20 mM KCl， 16 mM MgSO₄，20 mM (NH₄)₂SO₄，0.2% Tween 20，1.6 M Betaine和2.8 mM dNTP组成。

6.根据权利要求4所述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用试剂盒，其特征在于，所述crRNA和LbCas12a的摩尔浓度比为1:1。

7.权利要求1～2任一项所述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物在非诊断治疗目的的非洲猪瘟病毒检测中的应用。

8.权利要求3～6任一项所述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用试剂盒在非诊断治疗目的的非洲猪瘟病毒检测中的应用。

9.一种非诊断治疗目的非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）使用DNA提取试剂盒提取样品中的核酸或对样品进行裂解释放核酸；

（2）将LAMP反应混合液共18.5 μl和提取的核酸2 μl 共20.5 μl加入到PCR管底部；

（3）将CRISPR反应混合液共4.5 μl加入到PCR管盖部；

（4）将PCR管置于63℃的反应器中进行30min LMAP扩增；

（5）瞬时离心后将CRISPR反应混合液离心到管底部，并与LAMP扩增产物充分混合；

（6）将PCR管置于37℃进行CRISPR荧光检测；

（7）将PCR管置于激发波长为485nm的透射光源下观察颜色变化确定检测结果。

10.根据权利要求9所述的一种非诊断治疗目的非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测方法，其特征在于，所述LAMP反应混合液由以下成分组成：LAMP反应缓冲液、内引物、外引物、BstDNA聚合酶、p72质粒模板、荧光试剂和DEPC水，所述的p72质粒模板中p72的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。