[发明专利]一种脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒

说明书

本发明公开一种脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒，包括用于扩增FMR1基因CGG重复区的特异性PCR扩增引物、随机锚定CGG重复区的第三引物、高热稳定性的DNA聚合酶、对照标准品、高GC反应缓冲液、dNTPs、Taq Extender Additive。通过三引物PCR反应扩增出各种大小不一致的序列，扩增产物进行毛细管电泳，通过与标准品比对计算CGG重复数，还能准确判断女性基因杂合与纯合。本发明的试剂盒用于脆性X综合征的群体筛查和产前诊断，能确切检出正常、前突变携带者、全突变患者及女性患者和携带者，试剂盒具有快速、高准确性、高通量、经济和安全特点。因此，该试剂盒具有良好的临床应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒。

背景技术

脆性X综合征是一种主要以智力低下为临床表现的X连锁隐性遗传病，在精神发育迟滞相关的遗传病中，其发病率仅次于21三体综合征，是已知最常见的X连锁遗传病，也是目前已知人类发病频率最高的单基因遗传病。脆性X综合征的发生与位于Xq27.3的FMR1基因5’端非编码区(CGG)n重复序列的异常扩增密切相关。FMR1基因1号外显子近5’端非编码区存在以CGG(胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤)为主的三核苷酸重复序列。该(CGG)n重复序列拷贝数在人群中表现出极大的异质性。正常人该序列的(CGG)n为6-45个；45-55个CGG称为中间区域或“灰色区域”；当(CGG)n达到55-200个时，为前突变。当(CGG)n超过200个之后，FMR1基因启动子常发生甲基化，导致FMR1基因转录受抑制或减弱，蛋白表达受阻，影响大脑发育，临床即可导致脆性X综合征的发生。

目前已报道人群的发病率中，男性发病率约为1/4000，女性发病率约为1/7000～8000，患者的临床表现主要包括中度到重度的智力发育不全、语言障碍，并伴有不同程度的体型异常：大头，大耳，突出的下颌和额头，高颚弓，过度伸展的关节和扁平足等，大多数男性患者在青春期发育后出现大睾丸；该病还伴有行为障碍：大多数患者性情孤僻或者多动，注意力不集中，过度兴奋等。然而，全突变的患者并不都表现典型的临床症状，女性患者由于还有另外一条正常的X染色体，临床症状通常不典型，很难通过临床表现来辨别患者。另外，女性人群中FMR1前突变携带率高达1.7％，前突变不仅与后代的再发风险相关，其本身也是一种致病突变。因此，通过对FMR1基因检测进行疾病筛查是解决该问题的重要手段，尤其在产前诊断和遗传咨询中意义重大，能够降低新生儿患儿的出生，降低该病的发病率提高人口素质。现有的FMR1基因检测方法包括甲基化特异性PCR，PCR扩增检测法，Southern印迹方法等，但上述方法存在无法检出前突变携带者、难以扩增出前突变携带者或全突变患者PCR产物、操作繁琐、通量低而限制了在临床上的应用；三引物PCR具有超强的扩增体系，可以避免常规PCR由于序列GC含量高扩增困难，随着(CGG)n重复数目的增加，PCR的扩增能力下降的问题。通常前突变携带者或全突变患者难以扩增出PCR产物，而且女性有两条X染色体，更增加了PCR检测的难度。三引物PCR即使无法扩增出重复序列的全长，但仍然可以与模板中的重复序列配对，扩增出一系列连续的较短的PCR产物。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺点，本发明提供了一种脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒，通过三引物扩增FMR1基因CGG重复区的拷贝数，产生连续的不同片段长度的PCR产物，形成连续梯形峰群，用于区分常规PCR扩增结果为正常CGG纯合子，还是正常和大片段CGG的杂合子，避免大片段CGG漏检，能够快速、准确地判断受检者是否为患者、前突变携带者，提高脆性X综合征的诊断率和携带者检出率，为降低出生缺陷率减轻国家和社会负担做出重大贡献。

本发明采用以下技术方案实现上述目的：

一种脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒，其特征在于：包括用于扩增包含CGG重复区域、5’侧翼区和3’侧翼区的引物对FMR1-F、FMR1-R；用于随机锚定CGG重复区域并与特异性引物对组合产生不同大小扩增子的第三引物FMR1-CGG，其序列为：