[发明专利]一种用于检测JAK2基因的引物组合物和探针、试剂盒以及方法

说明书

本申请提供一种用于检测JAK2基因的引物组合物和探针，其特征在于，所述引物组合物包括用于检测突变型基因的引物对，以及用于检测野生型基因的引物对；所述用于检测突变型基因的引物对含有Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物；所述用于检测野生型基因的引物对含有Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.3所示序列的下游引物；所述探针为Seq ID No.4所示序列；其中，各引物5’端的M为不与JAK2基因互补的核酸序列，用于增加各引物的GC含量。本申请用于检测JAK2基因的引物组合物和探针，增强了引物和扩增模板的特异性结合，当M被引入扩增模板时，引物和JAK2基因互补区域的Tm值升高，能够实现有效退火，从而提高了检测JAK2基因突变的灵敏度。

技术领域

本申请涉及基因突变检测领域，具体涉及一种用于检测JAK2基因的引物组合物和探针、试剂盒以及方法。

背景技术

骨髓增殖肿瘤(myeloproliferative meoplasm，MPNs)是一组起源于多功能造血干细胞的恶性肿瘤，其特征为一系或多系骨髓造血细胞异常克隆性增殖，包括真性红细胞增多症(polycythemia，PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocthemia,ET)以及原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis,PMF)等。

Janus kinase(JAKs)是一类非受体型酪氨酸蛋白激酶家族，目前有JAK1、JAK2、JAK3、TYK2四个成员。JAK激酶具有高度同源的结构域：在羧基端有一个处于活化状态的激酶结构域(JAK同源性的JH1结构域)和一个催化“非活化状态激酶”的伪激酶结构域(JH2结构域)。研究表明，JH2伪激酶结构域有野生型JAK2和JAK2V617F突变型两种。JAK2V617F突变是14外显子的鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)，致使JAK2的JH2伪激活结构域1849位置的核苷酸发生改变，从而导致第617位密码子的缬氨酸被苯丙氨酸替换。缬氨酸变为苯丙氨酸后降低了JH2伪激酶结构域对JAK2激酶结构域的负调控作用，自动激活JAK2激酶结构域，使得细胞因子信号转导通路过度活化，从而引起含有JAK2V617F突变的细胞对造血细胞因子的刺激敏感性增加，导致红细胞、白细胞、血小板等血细胞异常增殖的发生，从而导致骨髓增殖性肿瘤的发生。

有报道指出，在大多数BCR-ABL1基因阴性的MPNs患者中JAK2V617F突变检测呈阳性，其中，95％以上的PV患者，65％以上的PMF患者中JAK2V617F突变检测均呈阳性。

针对JAK2基因突变情况，常用的检测方法为测序法。但是测序方法价格昂贵，过程复杂，耗时时间长，不利于临床快速诊断。JAK2基因突变还可以通过扩增受阻突变PCR(ARMS-PCR)方法检测，扩增受阻突变PCR可在理想PCR条件下检测到单基因突变，可区分JAK2V617F突变个体是纯合子还是杂合子，是检测MPNs病人有无突变的可靠方法，但是此方法的缺点是灵敏度低，仅为1％-2％。

因此，如何提高检测灵敏度是检测JAK2基因突变的难点。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于检测JAK2基因的引物组合物和探针，用于检测JAK2基因的试剂盒以及方法。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种用于检测JAK2基因的引物组合物和探针，用于检测JAK2基因的引物组合物包括用于检测突变型基因的引物对，以及用于检测野生型基因的引物对；用于检测突变型基因的引物对含有Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物；用于检测野生型基因的引物对含有Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.3所示序列的下游引物；用于检测JAK2基因的探针为Seq ID No.4所示序列；

Seq ID No.1：5’-M-TGTGATCCTGAAACTGAATTT-3’