[发明专利]一种核酸检测的曲线建立方法、检测方法及其试剂盒

说明书

本发明涉及一种核酸检测的曲线建立方法、检测方法及通过该方法实现核酸快速检测的试剂盒，本发明的曲线建立方法结合磁球分离与时间分辨荧光检测技术，充分利用磁球可快速分离和富集痕量核酸，通过后续的杂交链式反应，大幅提高磁球表面特异性吸附的时间分辨荧光探针的浓度，从而放大荧光信号，建立核酸浓度‑时间分辨荧光强度工作曲线，之后基于工作曲线可以根据待测目标物的荧光强度计算得出待测目标物的核酸浓度。所述检测方法提高检测灵敏度和特异性的同时还能缩短检测时间，本发明的核酸快速检测试剂盒可用于新冠病毒核酸的快速检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种核酸检测的曲线建立方法、检测方法及其试剂盒。

背景技术

核酸检测在疾病诊断，病源微生物、病毒的检测领域具有极其重要的作用。核酸检测就是对致病微生物的DNA或RNA的序列进行分析，然后通过分析结果来确诊病情。通过核酸检测就能知道是否存在病毒感染的情况，有助于及时发现病情。目前新冠病毒感染就是通过核酸检测来进行诊断的，如果核酸检测结果呈现阳性，就可以判断感染了新冠病毒。

核酸检测需要使用分子生物学方法来实现。核酸检测使用的方法是PCR扩增，步骤比较多。目前为了提高核酸检测的灵敏度，一般采用结合荧光检测法的荧光定量PCR方法，虽然这种检测方法具有较高的检测灵敏度，但是只能在中心实验室开展，且检测时间长，无法在现场进行快速检测，且容易受到杂散光以及样本内自发荧光的干扰，检测灵敏度仍然有限。目前亟需一种能显著缩短检测时间、大幅度提高检测灵敏度和特异性的核酸检测方法，这在全球新冠病毒疫情肆虐的背景下具有极为重要的意义。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种利用时间分辨荧光的核酸快速检测方法及其试剂盒，通过设计可与目标待测物部分互补的两段捕获链，其中第一捕获链与磁球连接，第二捕获链可引发发卡结构时间分辨荧光探针结合，通过磁球可实现目标待测物从样本中分离，再利用替换链在较高温度时与捕获链有高于目标物的结合能力，将磁球及荧光探针替换下，通过测定溶液中的荧光信号，实现对目标物的高灵敏度高特异性快速检测。

本发明提供一种核酸检测的曲线建立方法，包括如下步骤：

S1：设计第一捕获链、第二捕获链和替换链的序列，所述第一捕获链、第二捕获链均能与目标核酸序列互补配对，替换链可代替目标核酸与第一捕获链、第二捕获链互补配对。替换链在较高温度时与第一捕获链、第二捕获链具有更好的互补配对能力，所以可替换目标核酸序列；

S2：获得修饰有第一捕获链的磁球分散液；

S3：向步骤S2的修饰有第一捕获链的磁球分散液中加入第二捕获链和一系列不同浓度的目标核酸，混合反应，第一捕获链和第二捕获链结合在目标核酸的不同部位，实现磁球对目标核酸的完全捕获；

S4：加入时间分辨荧光发卡核酸探针，第二捕获链与所述时间分辨荧光发卡核酸探针发生链式杂交反应；

S5：加入替换链，混合反应，把磁球和时间分辨荧光发卡核酸探针替换下；

S6：吸附磁球，回收剩余的溶液部分；

S7：检测S6溶液部分的时间分辨荧光强度，建立核酸浓度-荧光强度工作曲线。

本发明还提供一种使用所述曲线建立方法所获得的核酸浓度-荧光强度工作曲线来进行核酸快速检测的方法，包括如下步骤：

S1：获得修饰有第一捕获链的磁球溶液，所述第一捕获链能够与目标核酸序列互补配对；

S2：向步骤S1的修饰有第一捕获链的磁球溶液中加入第二捕获链和待测目标物，混合反应，第一捕获链和第二捕获链结合在待测目标物的核酸的不同部位，实现磁球对目标核酸的完全捕获；

S3：加入时间分辨荧光发卡核酸探针，第二捕获链与所述时间分辨荧光发卡核酸探针发生链式杂交反应；