[发明专利]检测人MLH1基因甲基化的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.检测人MLH1基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括检测或测量受试样品DNA中MLH1基因甲基化状态或水平的特异性引物和探针。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括括检测或测量受试样品DNA中ACTB基因甲基化状态或水平的特异性引物和探针。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，包括用于检测MLH1基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ IDNO:1-2和探针SEQ ID NO:3、特异性引物SEQ ID NO:4-5和探针SEQ ID NO:6、特异性引物SEQ ID NO:7-8和探针SEQ ID NO:9；

和/或，包括用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQ ID NO:10-11和探针SEQID NO:12。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交；

和/或，所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12是基于TaqManTM设计的，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。

5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述MLH1基因探针SEQ ID NO:3、6、9核苷酸序列5’端标记Cy5，3’端标记QSY；

和/或，所述ACTB基因探针SEQ ID NO:12核苷酸序列5’端标记VIC，3’端标记MGBNFQ。

6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11和所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12的长度为10-50nt。

7.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含下述组成部分：dNTP混合溶液、MgCl₂溶液、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、PCR去离子水；

和/或，所述试剂盒中还包含下述组成部分：血浆游离DNA提取试剂和血浆游离DNA甲基化转化试剂；

和/或，所述血浆游离DNA甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐；

和/或，所述受试样品DNA为完整基因组、无细胞DNA或循环肿瘤DNA。

8.一种根据权利要求1-7任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取血浆游离DNA；

(2)将提取的血浆游离DNA进行甲基化转化并纯化，优选采用亚硫酸氢盐为血浆游离DNA甲基化转化试剂；

(3)将进行甲基化转化并纯化的血浆游离DNA进行荧光定量PCR扩增，PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间，Ct值小于40的扩增认定为阳性；

(4)结果判定：当内部参照位点ACTB检测结果阳性，MLH1靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性；

优选地，所述第(3)步骤中，每个模板的PCR扩增做三个重复；

和/或，每个反应体系10μL，其中含(0.5-1.5μL)1xPCR反应缓冲液、200-400μm dNTPs、3-6mM MgCl₂、1-3U AmpliTaq Gold DNA聚合酶；

和/或，MLH1基因区域靶点的引物各300-500nM；

和/或，MLH1基因区域靶点的探针各200-300nM；

和/或，ACTB基因区域靶点的引物150-250nM，ACTB基因区域靶点的探针50-150nM；

和/或，PCR扩增条件为：90-100℃预变性8-12min；90-100℃变性10-20s，60-70℃退火和延伸60-70s，40-50个循环。