[发明专利]肝癌早期的预警方法、及预警用检测试剂盒、检测方法

权利要求书

1.一种肝癌早期的预警方法，其特征在于，通过PCR法检测外周血样本中RASSF1A、ELF、p16和GSTP1基因的DNA甲基化水平，计算罹患肝癌的风险值，并根据计算结果进行预警；计算公式为：

Y＝1.208163-0.00653×Ct(RASSF1A)-0.00751×Ct(ELF)-0.00555×Ct(p16)-0.00457×Ct(GSTP1)；

当Y≥0.3177时，判断为罹患肝癌高风险，当Y0.3177时，则判断为罹患肝癌低风险。

2.根据权利要求1所述的一种肝癌早期的预警方法，其特征在于，所述Ct(RASSF1A)表示RASSF1A经过内源参照的校准后的扩增水平，

所述Ct(ELF)表示ELF经过内源参照的校准后的扩增水平，

所述Ct(p16)表示p16经过内源参照的校准后的扩增水平，

所述Ct(GSTP1)表示GSTP1经过内源参照的校准后的扩增水平。

3.肝癌早期预警用多基因甲基化联合检测试剂盒，其特征在于，包括特异性检测外周血样本中RASSF1A、ELF、p16和GSTP1基因的DNA甲基化检测试剂。

4.根据权利要求3所的检测试剂盒，其特征在于，还包括内源性基因和内源性基因检测试剂；；优选地，所述内源性基因为β-actin或RPPH；优选地，所述检测试剂盒为荧光PCR检测试剂盒。

5.根据权利要求3或4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA甲基化检测试剂包括用于RASSF1A、ELF、p16和GSTP1基因启动子区域进行甲基化特异性PCR(MSP)扩增的DNA引物对及探针。

6.根据权利要求5所述的R检测试剂盒，其特征在于，RASSF1A的扩增引物对的核苷酸序列为：

正向引物GGGTTTTGCGAGAGCGCG；

反向引物GCTAACAAACGCGAACCG；

针对RASSF1A的探针核苷酸序列为GCTCTTCCCAGCGCGCTCA；优选地，针对RASSF1A的探针连接有荧光基团；更优选地针对RASSF1A的探针标记FAM荧光素。

7.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，ELF的扩增引物对的核苷酸序列为：

正向引物GGCGAGTGGTTTTTGATAAAATTATAAAT；

反向引物ACATACCACGATTACCGAACCCGAA；

针对ELF的探针核苷酸序列为CGGCACTCGTACGTCAACCGCG；优选地，针对ELF的探针连接有荧光基团；更优选地针对ELF的探针标记HEX荧光素。

8.根据权利要求5所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，p16的扩增引物对的核苷酸序列为：

正向引物TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC；

反向引物GACCCCGAACCGCGACCGTAA：

针对p16的探针核苷酸序列为ACCGCGTAGCTCAGTCCTTA；优选地，针对p16的探针连接有荧光基团；更优选地针对p16F的探针标记CY5荧光素。

9.根据权利要求5所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，GSTP1的扩增引物对的核苷酸序列为：

正向引物TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC；

反向引物GCCCCAATACTAAATCACGACG：

针对GSTP1的探针的核苷酸序列为ACCGGGTCGCATGGGCCAATCG；优选地，针对GSTP1的探针连接有荧光基团；更优选地针对GSTP1的探针标记ROX荧光素。

10.一种非诊疗目的检测人RASSF1A、ELF、p16和GSTP1基因的DNA甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将待测样品进行重亚硫酸氢盐处理，得到重亚硫酸盐修饰的待测样品；

S2.采用权利要求2-9任意一项所述的PCR检测试剂盒对S1得到的待测样品进行检测，获得人RASSF1A、ELF、p16和GSTP1基因的DNA甲基化水平。