[发明专利]检测水稻重组蛋白质中残留DNA的引物对及方法

说明书

本发明提供了检测水稻重组蛋白质中残留DNA的引物对及探针、包含该引物对及探针的试剂盒以及利用该引物对及探针检测水稻重组蛋白质中残留DNA的方法，所述引物对及探针特异性结合水稻基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段。利用所述引物对及探针的PCR检测方法操作简便快捷、灵敏度高、能区分大肠杆菌、人类、仓鼠等干扰性DNA。

技术领域

本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及检测水稻重组蛋白质中残留DNA的引物、检测试剂以及利用所述引物和检测试剂检测水稻重组蛋白质中残留DNA的方法。

背景技术

在现代，生物重组制品已广泛应用于医药健康领域，发挥着越来越重要的作用。这些生物制品包括重组蛋白药物、基因重组疫苗、生物抗原抗体以及各种细胞因子等。重组生物制品的应用与人类健康事业息息相关，国际上对其的质量控制和安全性检测都具有极其严格的要求。

植物为重组蛋白药物的生产提供了平台。其中谷类作物的种子，如水稻、玉米和大麦，都是理想的寄主。水稻种子已成功表达了多种重组蛋白，如人α-抗胰蛋白酶、T细胞表位肽、人血清白蛋白等。

重组生物蛋白中会残留来自宿主的非目标产物，这些产物是终产物中主要的杂质来源，直接影响生物制品的安全性，其中残余DNA是一个非常重要的污染。因此，对它的检测是重要的质量控制环节。

理论上，存在于生物制品中的微量DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当一定量的残留DNA与制品一同进入人体后，含有致癌基因的DNA片段就可能诱发肿瘤的产生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA，则这种DNA通过表达后具备感染性，从而导致一系列的不良后果。

从1984年开始，国际官方机构陆续推出了针对生物制品残余DNA检测的各种限度标准，并且根据研究及应用的不断变化而逐步修改完善。1997年，WHO第46届生物制品标准化专家委员会(ECBS)会议上，与会专家通过对传代细胞系残余DNA风险的再评估，认为残余DNA虽然不是主要危险因素，但应视为细胞污染物，要求清除至最低水平。根据这一再评估，建议每人份传代细胞的纯化产品中可接受的DNA含量为10ng。任何生物制品的纯化工艺应经验证，证明其去除细胞DNA的能力，包括参入示踪剂研究。另外，产品批次间的均一性应通过临床效果观察，以及三批以上的检测结果予以证实。目前重组蛋白药物常用的哺乳动物细胞系，如CHO、BHK、SP2/0、C127等，均有逆转录病毒颗粒阳性的报道。因此，对其残余DNA含量就需要严格控制。

目前，针对不同的生物制品，其相对应的检测限也略有不同。一般而言，FDA规定医药生物制品中DNA污染的检测限为100pg/剂，WHO和EU略为宽松，检测限可达10ng/剂。低浓度的检测限对检测的手段及技术提出了更高的要求。

关于生物制品中宿主细胞残余DNA的限量检测，过去比较普遍的采用分子杂交的半定量方法。该方法基于传统的分子基因杂交技术，需要的检测条件相对简单，检测限在10pg左右基本能够满足一些疫苗和治疗性生物制品的检测需求。但由于该方法存在时间长、操作繁琐、稳定性、敏感性、特异性较差等缺点，已经不能满足日益严苛的检测要求，在一些发达国家已经淘汰。qPCR方法由于其灵敏度，准确度，精密度和方便操作等特点，被认为是最实用的残留DNA定量检测方法。

至今没有关于水稻残留DNA的定量分析方法，因此开发一种灵敏的方法来定量检测水稻做为宿主的蛋白药物中的DNA残留非常有必要，该方法应具备特异性、灵敏性、操作简便、标准统一等优点，从而能用于生物制品质量控制。

发明内容

本发明的目的在于提供检测水稻重组蛋白质中残留DNA的引物和检测试剂，从而能够灵敏、简便、特异性地检测水稻重组蛋白质中残留DNA。

本发明的另一目的在于提供利用所述引物和检测试剂来检测水稻重组蛋白质中残留DNA的方法。