[发明专利]一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及基于微流控芯片Digital PCR的检测方法

说明书

本发明属于检验检疫技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及基于微流控芯片Digital PCR的检测方法。所述引物探针组合中引物对的核酸序列如SEQ ID NO.1~2所示，所述引物探针组合中探针的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述引物探针组合用于扩增非洲猪瘟病毒的B646L基因的保守序列，所述保守序列具体如SEQ ID NO.4所示。当利用该引物探针组合进行基于微流控芯片Digital PCR时，对非洲猪瘟病毒的最低检测限可以低至每微升模板30.1995 copies，且Digital PCR具有很好的重复性，其平均CV值为9.56%。

技术领域

本发明属于检验检疫技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及基于微流控芯片Digital PCR的检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染家猪或野猪引起的一种急性、出血性、高度接触性传染病，其特征是病程短、高热和出血性病变，急性感染死亡率高达100％，严重威胁全球养猪业但目前尚未开发出有效的疫苗和治疗方法。ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，为大型双链DNA病毒，主要在巨噬细胞胞质中复制，其基因组约170-193kb，含有150-167个开放阅读框，编码150-200种蛋白质。目前已知功能的病毒编码蛋白约有50个，大部分为病毒的结构蛋白，仍有一半以上的ASFV编码蛋白功能尚不清楚。

目前，非洲猪瘟的诊断方法包括红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验、动物接种试验、ELISA、聚合酶链反应等。其中红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验的敏感性不高和特异性不强，动物接种试验不安全。实验室常规的ASFV诊断方法是病毒分离(VI)，尽管该方法可靠且敏感，但所需时间长达6天。聚合酶链反应(PCR)是一种替代VI的快速检测ASFV的方法，特别适用于筛选质量较差或降解的带有不可恢复病毒的样本。传统PCR检测非洲猪瘟病毒的方法具有特异、敏感、快速的特点，但有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。第二代PCR技术，即荧光定量PCR(qPCR)检测技术，通过染料或者探针释放荧光，实时监控每一个PCR循环的荧光变化，最后生成扩增曲线，如果是染料法，最后还可以生成熔解曲线，分析产物的特异性。但其检测灵敏度不高，没法做绝对定量。第三代PCR技术，即数字PCR(Digital PCR)技术，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含零个或一个(至多数个拷贝)的目标分子，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行统计学分析。与传统的qPCR技术相比，Digital PCR具有极高的灵敏度、特异性和精确性。因此，本发明的目的是建立一种基于微流控芯片Digital PCR平台的非洲猪瘟病毒的检测技术，以期为非洲猪瘟的防控提供有效的技术支持。

发明内容

本发明的技术目的是提供一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及基于微流控芯片Digital PCR的检测方法，从而准确定量出待检测血清中非洲猪瘟病毒拷贝数，该方法检测灵敏度高，检测过程简单，检测时间短。

为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合，所述引物探针组合中引物对的核酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述引物探针组合中探针的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述引物探针组合用于扩增非洲猪瘟病毒的B646L基因的保守序列，所述保守序列具体如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述探针的5′端修饰有发光的荧光基团，3′端修饰有荧光淬灭基团。

优选的，所述发光的荧光基团为FAM；所述荧光淬灭基团为MGB。

一种所述引物探针组合在检测非洲猪瘟病毒中的应用。