[发明专利]与肝损伤内质网应激未折叠蛋白反应相关的ERO1α的分子标志物的筛选方法及其应用

说明书

本发明公开了一种与肝损伤内质网应激未折叠蛋白反应相关的ERO1α的分子标志物的筛选方法及其应用，以CBS^+/‑基因敲除小鼠和肝细胞为研究对象，提取组织或细胞的RNA和蛋白，筛选出与HHcy诱导肝损伤相关的基因，在细胞水平验证ERO1α和UPR相关蛋白的表达变化，建立了由ERO1α和UPR蛋白基因网络组成的Hcy诱导肝损伤特异性疾病联合诊断方法。该方法简单可靠，取材方便，灵敏度和特异性均与生化诊断的结果高度吻合，在HHcy诱导肝脏损伤性疾病的早期诊断与预后评估中具有极大的应用价值。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与肝损伤内质网应激未折叠蛋白反应相关的ERO1α的分子标志物的筛选方法及其应用。

背景技术

同型半胱氨酸(Hcy)是蛋氨酸的核酸甲基化和去甲基化过程中产生的含硫醇的非蛋白质氨基酸，血浆中Hcy的浓度超过15μmol/l血浆被定义为高同型半胱氨酸血症(HHcy)。参与多种疾病的发病，包括高血压和冠状动脉疾病等。Hcy在体内主要通过再甲基化和转硫作用这两种重要方式进行代谢，转硫途径在Hcy引起肝脏损伤过程中发挥着重要的作用，该过程中主要受到胱硫酶醚合成酶(CBS)的调控，当CBS的合成减少，使得Hcy不能够充分的通过转硫途径转换为胱硫醚，造成了在体内的Hcy蓄积，造成肝脏的进一步的损伤。

病理状态下蛋白质错误折叠或破坏正常折叠过程会导致错误折叠的蛋白质在内质网聚焦造成内质网膨胀，导致内质网应力并激活未折叠蛋白反应(UPR)，ER除了严格参与蛋白质折叠、运输、分泌和降解的功能外，ER现在被认为在新陈代谢、炎症以及细胞分化和存活中发挥着重要的生理作用。因此，由细胞对内质网功能的需求和内质网容量之间的不平衡引起的内质网应激，在肝脏损伤过程中成为肝脏炎症反应和细胞死亡机制激活的重要因素。在内质网应激反应中，未折叠蛋白反应(UPR)的信号上调，抑制蛋白质合成并激活蛋白质降解，目前三种内质网跨膜蛋白被鉴定为内质网应激的信号传感器：IRE1a、PERK和ATF6。这些蛋白质通常通过与GRP78结合而处于非活性状态，在内质网应激后释放。活化的PERK磷酸化真核细胞翻译起始因子2(eIF2a)的a亚单位，从而抑制蛋白质翻译，减少内质网腔中新合成的蛋白质。激活的IRE1诱导内质网伴侣转录上调并启动JNK-1介导的促凋亡反应以清除受损细胞。当损伤过度且内质网功能未恢复时，ATF6作为一种从内质网膜释放的转录因子，通过诱导转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达增加促进caspase3的活化诱导细胞死亡。但是内质网应激是否调控Hcy有引起的肝脏损伤并未见报道。

内质网氧化酶1(ERO1α)，一种ER定位的蛋白质二硫异构酶(PDI)氧化酶，从还原的PDI中接收电子并将其传递给分子氧，催化氧介导的二硫键形成，ERO1α氧化PDI从分子氧形成过氧化氢生成氧化应激，导致ER内环境失调导致细胞死亡增加，因此ERO1α在介导细胞凋亡和损伤过程中发挥着重要的作用。但是ERO1α是否介导HHcy诱导的肝损伤机制是未知的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与肝损伤内质网应激未折叠蛋白反应相关的ERO1α的分子标志物的筛选方法及其应用，该方法开发一种针对早期防治肝脏损伤的治疗靶标，抑制肝脏过度损伤的分子ERO1α，该发明中组织标本来自于雄性CBS^+/-基因敲除小鼠，细胞是人源的肝细胞，主要的检测指标主要有使用全自动生化仪器分析肝损伤指标AST和ALT的表达，分析血浆中Hcy的水平，流式细胞术检测不同浓度干预肝细胞后肝细凋亡状态，使用MTT检测肝细胞的增殖状态，使用western blot检测CBS^+/-基因敲除小鼠肝脏和Hcy干预肝细胞后内质网应激未折叠蛋白反应和ERO1α的表达，使用透射电子显微镜检测CBS^+/-小鼠肝脏粗面内质网是否发生明显膨胀，内质网腔扩张，液泡形成，核糖体扩张等现象。将ERO1α过表达或者干扰后western blot检测内质网应激未折叠蛋白反应的相关蛋白GRP78、PERK、ATF6和XBP1的检测。

其技术方案如下：