[发明专利]一种利用空斑染色测定伪狂犬病毒滴度的方法

说明书

本发明公开一种利用空斑染色测定伪狂犬病毒滴度的方法，以CV‑1细胞作为检测伪狂犬病毒的指示细胞，利用结晶紫染色并读取病毒空斑数目，根据空斑数目结合对应的稀释倍数计算伪狂犬病毒的滴度。本发明中的指示细胞与伪狂犬病毒有高度敏感性，能产生易于观察的病毒空斑，且病毒滴度与产生的空斑数目呈良好线性关系，稳定性、重现性好，灵敏度高，适用于病毒的清除/灭活验证研究。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于病毒清除/灭活验证研究的指示病毒-伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PrV)滴度的精确测定。

背景技术

全人源单克隆抗体技术中有一种是单个B细胞抗体制备技术，主要是EB病毒(Epstein-Barr virus)转化B细胞技术，是利用EB病毒在体外能感染正常的B细胞，使之变成永生化的淋巴细胞系的原理，制备分泌人单抗的杂交瘤细胞，因此应确认此类产品生产工艺能否清除/灭活疱疹病毒。生物技术产品的病毒安全性评价指导原则ICH Q5(A)中对病毒清除/灭活研究中病毒的选择提出要求，病毒指示病毒进行定义：“相关”病毒与“模型”病毒。伪狂犬病毒是与EB病毒密切相关的病毒(同属)，因此可作为疱疹病毒清除/灭活研究的特异性“模型病毒”。

伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PrV)也称之为Suid疱疹病毒1型，属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科。PrV是双链DNA包膜病毒，在自然条件下，能够感染猪、牛、犬、鼠等哺乳动物。PrV致病性强，感染性也强，并且死亡率高。猪(包括家猪和野猪)通常是这一病毒的贮存宿主，目前没有证据表明人类可被感染。PrV在pH 4-12范围内保持稳定性，可在低温下保持感染性数周，但不耐高温；PrV易受消毒剂的影响，邻苯酚酚盐化合物，过氧乙酸，福尔马林，2％氢氧化钠，碘化磷酸三钠消毒剂，1-2％季铵化合物，次氯酸盐(漂白剂)和洗必泰均可使其失活。

PrV的体外测定方法多为酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测病毒的抗原表位或待检样品的抗体水平，或实时荧光定量PCR来测定样品中病毒特异性核酸片段。这些方法开发多用于服务养殖业，尤其是养猪场伪狂犬病毒的快速鉴定，其目的并不是准确测定病毒的滴度，因此并不适用于病毒清除/灭活研究。

通过对中英文专利的检索，并没发现明确地应用空斑检测法测定PrV病毒滴度的专利。因此急需开发出一种有效的测定PrV病毒滴度的方法，使之适用于病毒的清除/灭活验证研究。

病毒清除/灭活研究是要验证客户生物制品纯化工艺中清除/灭活有感染活力的病毒的能力，而不是病毒的总和，因此病毒清除/灭活研究中需要一种能够准确测定活病毒的量的方法，这样才能准确的评价各个纯化步骤对病毒清除/灭活的效果。

本发明期望利用空斑染色准确测定有感染活力的PrV病毒，适用于病毒清除/灭活研究的需要。

空斑计数法准确定量测定PrV病毒滴度，需满足以下要求：PrV应对指示细胞具有高度敏感性，能够引起明显的细胞病变效应，并且能够在指示细胞上产生易于观察的病毒空斑；在一定的病毒滴度范围内，病毒的滴度与产生的空斑数目应呈良好的线性关系；测定结果应具有稳定性，不同时间、不同细胞批次、不同的操作者均不会影响实验结果，可重复性要好，检测灵敏度要高；该方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，都符合相关法规要求。

发明内容

现有技术中没有发现明确地应用空斑检测法测定伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PrV)滴度的方法。因此，本发明期望建立一种有效的测定PrV病毒滴度的方法，该方法中的指示细胞与PrV病毒有高度敏感性，能产生易于观察的病毒空斑，且病毒滴度与产生的空斑数目呈良好线性关系，稳定性、重现性好，灵敏度高，适用于病毒的清除/灭活验证研究。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：