[发明专利]一种利用空斑染色测定伪狂犬病毒滴度的方法

权利要求书

1.一种利用空斑染色测定伪狂犬病毒滴度的方法，其特征在于：

以CV-1细胞作为检测伪狂犬病毒的指示细胞，利用结晶紫染色并读取病毒空斑数目，根据空斑数目结合对应的稀释倍数计算伪狂犬病毒的滴度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将CV-1细胞接种于含细胞培养基的细胞培养六孔板中，至细胞汇合度为90％-100％；

(2)用制备好的多个不同稀释度的伪狂犬病毒去感染CV-1细胞；将接种病毒的细胞培养孔板转移入细胞培养箱中孵育，孵育后的细胞培养孔板取出并弃去病毒液，再添加细胞培养基-琼脂混合物，待覆盖在细胞表面的细胞培养基-琼脂混合物完全凝固后，将细胞培养板转移至细胞培养箱中培养3天；

(3)待细胞出现明显的空斑后，终止培养；对细胞进行固定，再加入染色液对细胞进行染色、洗净，晾干细胞培养孔板，并观察空斑形态，读取每孔的病毒空斑数目，计算病毒滴度。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，每个培养孔接种1.0×10⁵～3.0×10⁵个细胞。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，对病毒的稀释根据实际情况作10倍、3.2倍、或2.5倍进行系列稀释。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，每个培养孔中加入相同体积的接种量，每个稀释度病毒液做3个复孔。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将接种病毒的细胞板立即转移入细胞培养箱中，进行孵育；孵育期间每15至30分钟，轻轻晃动细胞板，使病毒液充分覆盖培养孔内所有细胞。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将孵育后的细胞培养孔板取出，弃去病毒液，在每孔中加入2.0mL预先准备好的细胞培养基-琼脂混合物，在室温下放置10至30分钟，直至覆盖在细胞表面的培养基-琼脂混合物完全凝固。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，细胞染色前，在每孔细胞中加入适量固定试剂，使其充分覆盖细胞培养孔，固定细胞至少一小时，将细胞板底部的细胞固定；较佳的，所述固定试剂为多聚甲醛固定试剂。

9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，固定完成后，去除细胞表面的固体琼脂，在细胞中加入适量染色液对细胞进行染色；染色1-2分钟后，弃去染色液，用清水洗净细胞；较佳的，所述染色液为0.5％结晶紫溶液。

10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，本发明所涉及到的试剂溶液配方如下：

步骤(1)中，所述细胞培养基为DMEM完全培养基；

步骤(2)中，伪狂犬病毒的稀释液为HEPES buffered EMEM；

步骤(2)中，所述细胞培养基-琼脂混合物的配方为：2×细胞培养基，1％低熔点琼脂糖。