[发明专利]一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒及其检测方法

说明书

本申请属于试剂盒技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述探针的长度为46～52个碱基，其中SNP位点后一位碱基或SNP位点互补碱基的后一位碱基被四氢呋喃(THF)替代，探针的5’端距THF至少间隔30个碱基，3’端距THF至少间隔15个碱基。本发明提供了一种快速用于基因分型检测的LNA‑恒温扩增的新方法。RMA技术反应条件较温和，不存在DNA模板高温变性，只需常温条件下就能进行反应；反应时间也较短，在15～30min就可以得到能检测到的扩增片段；通过荧光探针的使用，可以实现快速实时检测。而锁核酸修饰探针能够提高单碱基突变检测特异性，适用于基因分型检测。

技术领域

本申请属于试剂盒技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒及其检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)，指的是个体间DNA组序列同一位置单个核苷酸变异所引起的多态性。SNP位点是单个碱基的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，但大多数是转换。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因。SNPs的二态性，也有利于对其进行基因分型。目前，有许多方法被用来SNP的分型，如Taqman-MGB探针法、直接测序、限制性片段长度多态性分析法等。但是这些方法基本上全部依赖于PCR，操作复杂、检测周期长、需要复杂的仪器设备、成本较高。

重组酶聚合酶扩增(RMA)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。与PCR相比，RMA具有反应温度恒定、操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高等优点，特别适用于DNA或RNA的快速检测。其原理是重组酶与引物结合形成复合体，并在双链DNA中识别同源序列；然后重组酶解开双链，引物与同源序列发生链交换反应并启动DNA合成，对模板进行指数式扩增；被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。RMA产物的检测方法有凝胶电泳、实时荧光检测方法(real-time-RMA)、侧流层析(LFD-RMA)等。

锁核酸(LNA)是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，其结构中核糖的2'-O位和4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，提高了PCR反应中DNA分子的稳定性和亲和力。研究发现，在错配位点修饰1-3个锁核酸可明显提高单碱基错配的识别能力。LNA修饰的探针比传统的DNA探针有更高的灵敏度、稳定性、扩增效率和较低的探针浓度，是一种更为可靠的检测基因分型的方法。

本发明采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法进行基因分型检测，更加快速、简便，能够提高单碱基突变检测的特异性和灵敏度。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：

一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述探针的长度为46～52个碱基，其中SNP位点后一位碱基或SNP位点互补碱基的后一位碱基被四氢呋喃(THF)替代，探针的5’端距THF至少间隔30个碱基，3’端距THF至少间隔15个碱基。

优选的，所述试剂盒包括上游引物、下游引物、锁核酸修饰的检测SNP位点用的野生型探针(10μM)、锁核酸修饰的检测SNP位点用的突变型探针(10μM)、酶混合物、反应缓冲液、醋酸镁。

优选的，所述酶混合物包括大肠杆菌RecA蛋白、单链结合蛋白GP32、噬菌体UvsY蛋白、Bst聚合酶和核酸外切酶III。