[发明专利]一种用于扫描电子显微镜的细菌制样方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于扫描电子显微镜的细菌制样方法及试剂盒，属于微生物检验方法领域。所述制样方法包括如下步骤：1)将壳聚糖溶液覆盖于玻璃片，自然干燥，使玻璃片表面覆盖一层壳聚糖膜；2)将细菌悬液置于覆被壳聚糖膜的玻璃片表面，静置，使菌体吸附于壳聚糖膜；3)醛类溶液固定，磷酸盐缓冲液洗涤；4)梯度浓度乙醇溶液脱水；5)二氧化碳临界点干燥；6)镀金。所述试剂盒包括所述步骤1)所述的壳聚糖溶液。本发明的方法可将细菌牢牢固定在玻璃片上，便于扫描电子显微镜观察。

技术领域

本发明属于微生物检验方法领域。

背景技术

包括细菌在内的绝大多数生物样品具有含水量高，质地柔软、导电性差等特点，在进行扫描电镜观察前，要对样品作相应的处理，使其不含水分、最大限度保持样品的形貌、具有良好的导电性和较高的二次电子发射率。样品需要先用中性福尔马林或戊二醛等醛类溶液固定，以保持样品的形貌并使样品硬化；然后通过浓度梯度乙醇脱水处理，用乙醇逐步替换样品所含水分；接下来使用二氧化碳临界点干燥法去除样品中的乙醇，使样品完全干燥；最后用离子溅射法在样品表面镀一层金，使样品导电，便于扫描电镜观察。

现有的针对细菌样品的固定、清洗和脱水是在离心管里进行的，每步操作之后，需要通过离心将菌体和固定液、磷酸缓冲液和各浓度的乙醇分离，弃去上清液，然后加入下一步操作的溶液将菌体重悬，再重复上述操作。干燥好的菌体粉末还需要挑出粘到碳胶带上再通过离子溅射镀金。王伟等在模拟微重力环境对大肠杆菌形态与表面超微结构的影响研究[J].化学与生物工程，2011，28：14-17公开了用于扫描电镜的大肠杆菌制样方法，在固定、清洗、梯度脱水等步骤中，每步均需4000rpm离心3～5min，弃上清液，加入下一种试剂，滴管来回吸几下，打散菌块。邹如意等在用扫描电镜观察不镀导电膜对大肠杆菌损伤和图像的影响[J].安徽农业科学，2009，37：15692-15693公开了用于扫描电镜的大肠杆菌制样方法，在固定、清洗、梯度脱水等步骤中，每步均需3000rpm离心5min，菌体重悬后静置10min再离心、弃上清液，再重复上述操作。宋明珠等在金黄色葡萄球菌扫描电子显微镜样品快速制备的方法(申请号201610481585.2)中公开了用于扫描电镜的金黄色葡萄球菌的制样方法，在固定、清洗、梯度脱水等步骤中，每步均需8000rpm离心3～5min，弃掉上清液，加入下一种试剂，每次用移液枪吹打3～5次，打散菌块。上述已公开的论文及专利中，整个制样过程需要多次离心和重悬菌体，不仅耗费大量时间，而且在频繁的操作过程中容易导致鞭毛等细微结构的脱落；另一方面，多个离心管同时放入二氧化碳临界点干燥仪干燥，一旦气压变化稍有波动，容易造成菌体从离心管中喷出，导致样品交叉污染。

此外，王小东等在一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法(申请号201610965957.9)中公开了用于扫描电镜的细菌制样方法，主要是将糯米粉和鸡蛋清制成粘稠的粘片剂，将其与戊二醛固定之后的菌体混合，再将混合液粘附到载玻片上，自然干燥之后进行常规的梯度脱水。粘片剂的制备过程包括对糯米粉的研磨和干燥(温度必须达到130℃、持续时间不超过2h)以达到较好的糊化效果，鸡蛋清最好选用土鸡蛋的蛋清，过滤除菌要遵循微生物实验无菌操作的技术要求。此发明中粘片剂的制备较复杂，对原料要求高，而且粘片剂与菌体是混合在一起的，有可能造成部分菌体被粘片剂包裹，无法在扫描电镜下观察到完整的形貌。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种新的用于扫描电子显微镜观察的细菌制样方法。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种将细菌固定于玻璃片的方法，包括如下步骤：

1)将壳聚糖溶液覆盖于玻璃片，自然干燥，使玻璃片表面覆盖一层壳聚糖膜；

2)将细菌悬液置于覆被壳聚糖膜的玻璃片表面，静置，使菌体吸附于壳聚糖膜。

如前述的方法，步骤1)所述壳聚糖溶液浓度为0.1～3％(m/v)，优选地，为2.5％(m/v)。