[发明专利]一种扩增单细胞内核酸的方法

说明书

本发明公开了一种扩增单细胞内核酸的方法。所述方法包括：(1)将单个细胞捕获在皮升级至纳升级微小体积内；(2)对所述单个细胞进行原位裂解；(3)将扩增体系加入到微小体积内进行原位扩增。本发明中，通过在微小体积中进行单细胞核酸的扩增反应，一方面大幅压缩反应体积、增加有效模板浓度、排除外源性核酸污染和交叉污染，来降低扩增偏倚；另一方面可提升实验通量，达到高保真的单细胞核酸扩增效果及高通量生物学的实验要求。

技术领域

本发明涉及核酸扩增领域，具体涉及一种扩增单细胞内核酸的方法，特别是在皮升级至纳升级微小体积内对单细胞进行核酸扩增的方法。

背景技术

目前，高速发展的单细胞分析技术，将细胞领域的研究推进至单细胞时代。在诸多单细胞分析技术中，其至关重要的步骤为单细胞核酸扩增。单细胞扩增的主要方法包括：MDA(Multiple Displacement Amplification)、MALBAC(Multiple Annealing andLooping-Based Amplification Cycles)、LIANTI(Linear amplification viatransposon insertion)及PCR(Polymerase Chain Reaction)等。MDA，即多重置换扩增技术，该技术利用随机引物六聚体和聚合酶(包括但不局限于Φ29DNA聚合酶)进行结合与扩增。MALBAC，即多次退火环状循环扩增技术，该技术通过在八聚体引物5’端添加了27个固定碱基序列引入线性扩增和指数扩增特性。LIANTI，即通过插入转座子进行线性扩增的技术。PCR，该技术使用引物结合到DNA任何部位，从而通过随机扩增得到全基因组序列。由于单个细胞中所含核酸起始模板量极低，在利用上述扩增方法扩增单细胞时，会导致极高的扩增偏差和大量基因组片段丢失。据研究表明，在扩增反应中，反应体系体积在一定程度上与扩增偏差呈正比。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的缺乏有效扩增单细胞内核酸的方法的缺陷，提供一种扩增单细胞内核酸的方法。

本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题。

本发明第一方面提供一种扩增单细胞内核酸的方法，其包括：

(1)将单个细胞捕获在皮升级至纳升级微小体积内；

(2)对所述单个细胞进行原位裂解；

(3)将扩增体系加入到微小体积内进行原位扩增。

其中，步骤(1)中所述的皮升级至纳升级微小体积可为本领域中常规的皮升级至纳升级微小体积，例如可以为微液滴、凝胶微球或者微流控芯片中的微小反应室。较佳地：所述微液滴含6％w/v丙烯酰胺单体和N，N'-亚甲基双丙烯酰胺以及0.3％w/v过硫酸铵溶液，所述丙烯酰胺单体和所述N，N'-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为37.5:1；或者，所述微液滴含3％w/v琼脂糖水凝胶溶液。

对应以上所述形式的皮升级至纳升级微小体积，所述捕获优选通过以下方法之一实现：

1)制备单细胞悬液，将所述单个细胞捕获在微液滴中；

2)基于方法1)，在适宜条件下(包括但不局限于UV照射、温度改变、pH环境改变、液体中离子浓度改变等)，将包含所述单个细胞的凝胶液滴凝固成包含所述单个细胞的凝胶微球；

3)将所述单个细胞分离捕获在单个独立的微小反应室中。

使用方法2)时，在对所述单个细胞进行裂解后，可选择对包含所述单个细胞基因组的凝胶微球清洗或者不清洗；本发明中，优选对其进行清洗。清洗时，可使用无核酸酶水或者TE缓冲液等清洗。

其中方法3)中，所述微小反应室可包含在定制的微流控芯片中，即：根据需求、反应腔室大小，设计掩膜板的CAD文件，再进行光刻等微加工程序，从而获得符合实验需求的微流控芯片。