[发明专利]一种检测探针、其制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种检测探针、其制备方法及应用，属于生物领域；本发明方法通过使用minicircle质粒结合滚环扩增的方法扩增得到全长的探针片段，进一步通过超声打断制备得到不同长度需求的探针；本发明方法可用于生产DNA探针或者RNA探针，制备方法简单、产量大、成本低，可将制备周期缩短至1天。另外，本发明方法制备的探针长度不受限，可根据需要提供不同目标及不同长度的探针，均一性好、纯度高，大大地提高了探针的捕获性能，使得目标区域的测序均一性、深度更佳，更进一步降低实验成本。

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种检测探针、其制备方法及应用。

背景技术

近十几年来，NGS(二代测序技术)的快速发展使得DNA测序成本大幅降低，然而就现阶段而言，全基因组重测序的成本依然很高，且得到的海量数据分析速度缓慢，无法大规模地应用。靶向测序技术可以将感兴趣的基因组区域富集出来测序，单个样本测序数据产出少且分析速度较快，因此更能经济高效地发挥NGS技术的优势，广泛应用到临床检测、健康筛查等众多领域。另外，靶向测序可以对目标区域进行深度测序，增加了目标区域内遗传变异的检测灵敏度和准确性。在技术原理上，靶向测序的方法主要分为两种：杂交捕获测序和多重扩增子测序。

液相捕获是重要的辅助检测手段。液相杂交捕获测序可适用于几kb到上百Mb的基因组目标区域的检测，可检测SNV，InDel，CNV，SV，基因融合等变异。目前常用的应用包括针对不同的肿瘤基因设计相应的panel、明确疾病的易感基因及致病基因、病毒检测、线粒体检测等，应用非常广泛。

用于捕获的探针即可为DNA探针，也可为RNA探针。DNA探针主要依赖于化学合成和光合成等方法。合成形式又包括单条引物形式和oligo pool形式。单条引物形式方法，虽然产量高，能做上万次反应，但是价格昂贵；oligo pool形式，一次性能合成数万条探针，但是合成的pool一般每条引物的量是0.2fmol，需要进一步进行PCR扩增来进行探针制备。但是在PCR过程中会产生偏差，并且为了减少偏差会尽可能的减少循环数，一般为20循环。因此最终得到的探针会很少，导致每个捕获反应的成本上调。而RNA探针一般是基于扩增的DNA探针的基础上，再进行体外转录，转录过程中加入biotin-NTP，从而制备出RNA探针，从PCR到体外转录的过程能将探针扩增数千倍，虽然产生的探针量大，但是面临操作过程中损失部分探针，导致实际捕获时，探针覆盖均一性的性能下降，另一方面，RNA探针不易保存，容易降解。目前液相杂交捕获的难点和痛点在于探针的合成，主要是成本昂贵、扩增偏差、覆盖均一性差等问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种制备简单，且适用性好的检测探针。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种检测探针的制备方法，其包括以下步骤：

(1)、片段化minicircle质粒，得到minicircle质粒片段，所述minicircle质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)、将步骤(1)中的目标基因片段与minicircle质粒片段连接，并将连接产物转化至菌中，挑取相应的含有所述质粒片段的转化菌，扩大培养并提取质粒；

(3)、使用带有纯化标签的原料，以步骤(2)得到质粒为模板进行滚环扩增；

(4)、纯化回收步骤(3)的扩增产物，进行超声。

本发明的minicircle质粒不含质粒原核元件的其余序列，因此不会影响捕获效率。滚环扩增是一种扩增效率高于PCR的高效扩增体系，扩增效率常达数千倍，通常1ng的DNA可以得到1-10μg的产物；并且扩增过程中几乎不会发生突变；避免了目前探针合成面临的累计错误率的问题，因此得到的探针的均一性非常高。