[发明专利]一种DNA聚合酶及其在PCR检测中的应用

说明书

本发明涉及PCR检测技术，具体涉及一种DNA聚合酶及其在PCR检测中的应用。所述DNA聚合酶，是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白自N端到C端连接而成的融合蛋白，或者将所述融合蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的具有DNA聚合酶功能的蛋白质。该酶具有高保真性和高灵敏度，可用于低丰度模板的扩增检测、免提取‑直接PCR、taqman‑qPCR检测体系以及多重PCR检测体系。

技术领域

本发明涉及PCR检测技术，具体涉及一种DNA聚合酶及其在PCR检测中的应用。

背景技术

1983年Mullis等人发明了一种特异性DNA体外扩增技术——聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR，是一种在体外模拟体内DNA复制的核酸扩增技术，仅以少量的DNA分子作为模板，经变性-退火-延伸的多次循环，以接近指数扩增的形式产生大量的目标DNA分子的技术。短短数十年时间，随着PCR技术的发展，衍生出了各种基于PCR方法的新技术，比如：多重PCR、反转录PCR、荧光定量PCR、原位PCR、免疫PCR和数字PCR等。PCR技术以其高特异性、高灵敏性、操作简便、成本低廉的优点和可满足高通量、高速度、高灵敏、高特异检测和完全自动化的需求，使其应用范围从基本的基因扩增，扩展到基因克隆、基因改造、医学检验、指纹鉴定以及非生物领域，可以说当下只要是在分子层面上的研究，基本都会用到PCR技术。

成熟意义上PCR方法的核心是耐热型DNA聚合酶(DNA polymerase)，目前已经从海洋极端嗜热菌中开发出多种耐热型DNA聚合酶，如Taq、Tth、Pfu、KOD等广泛应用的品类。根据结构生物学和生物信息学分析，耐热型DNA聚合酶分为两个家族，其中A家族(如Taq、Tth)有两个功能域：5－3聚合酶功能域，5－3外切酶功能域；B家族(如Pfu、KOD)也有两个功能域：5－3聚合酶功能域，3－5外切酶功能域。从结构理论上和实际的应用情况来看，A家族酶与模板DNA的结合能力弱于B家族酶；A家族酶对于不同引物的适配性高于B家族；B家族酶在扩增产物的保真性上远高于A家族酶；B家族酶的产物扩增长度极限高于A家族酶。A家族中的Taq DNA polymerase因其引物适配要求低，扩增缓冲液条件简单，反应成功率高，虽保真性、灵敏度和扩增极限相对较低，也成为当前核酸分子诊断中最广泛使用的聚合酶品种。

为了提高Taq DNA polymerase的反应灵敏度、扩增效率和产物量极限，研究者们从90年代初期就开始对野生型Taq DNA polymerase进行随机突变、人工进化挖掘Taq DNApolymerase的应用潜力。

发明内容

为满足上述领域存在的需求，我们开发了一种重组DNA聚合酶，该酶具有高保真性和高灵敏度，可用于低丰度模板的扩增检测、免提取-直接PCR、taqman-qPCR检测体系以及多重PCR检测体系。

一方面，本发明提供一种DNA聚合酶，是如下a1或a2所述的蛋白质：

a1.由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白自N端到C端连接而成的融合蛋白；

a2.将a1所述的融合蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的具有DNA聚合酶功能的蛋白质。

在本发明的优选实施例中，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

编码所述DNA聚合酶的基因也属于本发明的保护范围。

在本发明的优选实施例中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

包含所述基因的表达盒、载体或重组菌也属于本发明的保护范围。