[发明专利]测定重组腺病毒感染滴度的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及测定DNA病毒感染滴度的方法，更具体涉及测定重组腺病毒感染滴度的方法。本发明提供一种测定DNA病毒感染滴度的方法，利用该方法可以精确、快捷的检测多种DNA病毒感染滴度。尤其是提供一种经优化的qPCR检测重组腺病毒感染滴度的方法，在保证被病毒感染的细胞完整性的前提下，通过在基因组提取前处理中先后使用蛋白酶K及benzonase核酸酶消除非感染性重组腺病毒基因组，使得测定结果与经典的TCID50测定结果相一致。该方法精确、快捷、稳定性好。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及测定DNA病毒感染滴度的方法，更具体涉及测定重组腺病毒感染滴度的方法。

背景技术

腺病毒呈无囊膜的球形结构，直径为70～90nm，其病毒粒子在感染的细胞核内常呈晶格状排列，每个病毒颗粒包含一个36kb的线性双链DNA，两端各有一个100～600bp的反向末端重复序列(inverted terminal re-peat，ITR)，ITR的内侧为病毒包装信号，是病毒包装所需要的顺式作用元件。基因组包含早期表达的与腺病毒复制相关的E1～E4基因和晚期表达的与腺病毒颗粒组装相关的L1～L5基因。线状双股DNA与核心蛋白形成直径为60～65nm的髓芯，被包裹于衣壳内。衣壳呈二十面体对称，由252个直径8～10nm的壳粒组成，壳粒排列在三角形的面上，每边6个，其中240个为六邻体(非顶点壳粒)，另12个为五邻体基底(顶点壳粒)。上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有47种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群(subgroup)。由于腺病毒具有宿主范围广、高转基因表达能力的特点，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。目前有许多人用治疗或者预防性重组腺病毒药物正用于临床试验。目前被广泛应用的腺病毒载体是人血清型腺病毒Ad2和Ad5型。

腺病毒的生活周期有两个阶段：第一阶段，腺病毒颗粒粘附和进入宿主细胞，将基因组释放到宿主细胞核中，以及有选择性地转录和翻译早期基因；第二阶段，病毒基因组复制和腺病毒晚期基因表达并最终释放成熟的感染颗粒。第一阶段通常在2～8个小时内完成。感染滴度测定是重组腺病毒制品生产中的一个关键质量控制指标。目前药典推荐的测定方法仅限于经典的TCID50法，该检测方法耗时长(通常10天左右)，要求操作者有一定的操作经验(主要是低浓度腺病毒感染细胞引起的细胞病变不明显，不容易镜检观察判定)，可重复性有限，为精确测定带来极大挑战。

因此，亟需开发一种稳定、快捷、精确的测定腺病毒感染滴度的方法。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种测定DNA病毒感染滴度的方法，利用该方法可以精确、快捷的检测多种DNA病毒感染滴度。尤其是提供一种经优化的qPCR检测重组腺病毒感染滴度的方法，在保证被病毒感染的细胞完整性的前提下，通过在基因组提取前处理中先后使用蛋白酶K及benzonase核酸酶消除非感染性重组腺病毒基因组，使得测定结果与经典的TCID50测定结果相一致。该方法精确、快捷、稳定性好。

为此，本发明第一方面提供一种测定DNA病毒感染滴度的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：

1)病毒接种细胞样品，获得病毒感染后的细胞样品；

2)对病毒感染后的细胞样品进行蛋白酶K消化，后进行核酸酶消化，之后使核酸酶失活，获得处理后细胞样品；

任选地，在感染后的细胞样品进行蛋白酶K消化后，加入蛋白酶K抑制剂抑制蛋白酶K活性，随后进行核酸酶消化；

3)提取处理后细胞样品总DNA，获得待测病毒感染滴度的DNA样品；

4)利用qPCR检测待测病毒感染滴度的DNA样品中病毒的基因组拷贝数，获得病毒感染滴度。