[发明专利]测定重组腺病毒感染滴度的方法

权利要求书

1.一种测定DNA病毒感染滴度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)利用病毒感染细胞样品；

2)对病毒感染后的细胞样品进行蛋白酶K消化，后进行核酸酶消化，之后使核酸酶失活，获得处理后细胞样品；

任选地，在感染后的细胞样品进行蛋白酶K消化后，加入蛋白酶K抑制剂抑制蛋白酶K活性，随后进行核酸酶消化；

3)提取处理后细胞样品总DNA，获得待测DNA样品；

4)利用qPCR检测待所述DNA样品中病毒的基因组拷贝数，获得病毒感染滴度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述核酸酶选自DNase I、DNaseⅡ和Benzonase核酸酶中的至少一种，优选地，所述核酸酶为Benzonase核酸酶和/或DNase I，进一步优选地，所述核酸酶为Benzonase核酸酶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述蛋白酶K的终浓度为0.05～5mg/ml，优选0.1～4mg/ml，进一步优选为1～3mg/ml；所述蛋白酶K的处理时间为0.15～4h，优选0.25～3h，进一步优选0.5～2h；所述蛋白酶K的处理温度为20～40℃，优选25～38℃，进一步优选30～37℃。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述核酸酶的终浓度为25～500U/ml，优选100～400U/ml，进一步优选150～300U/ml；所述核酸酶的处理时间为0.5～24h，优选2～20h，进一步优选5h～18h，更进一步优选12h～16h；所述核酸酶的处理温度为20～40℃，优选25～38℃，进一步优选30～37℃。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述蛋白酶K抑制剂选自Odanacatib、E64、亮肽素、DFP、AEBSF、PMSF中的至少一种，优选地，所述蛋白酶K抑制剂为PMSF。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，使核酸酶失活包括热失活。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，以待测DNA样品为模板，利用所述DNA病毒的特异性引物对进行qPCR扩增，根据Ct值及系列梯度浓度标准品的标准曲线，获得病毒滴度。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述系列梯度浓度标准品的标准曲线通过以下方法获取：

对已知浓度的标准品质粒进行与所述待测DNA样品同样的qPCR扩增过程，获得模板样品拷贝数与qPCR测定的Ct值之间的关系，绘制标准曲线，

其中，所述标准品质粒中含有所述DNA病毒特异性引物扩增序列。

9.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测DNA病毒感染滴度，所述试剂盒包括所述DNA病毒的特异性引物对和已知浓度的标准品质粒，其中，所述标准品质粒中含有所述DNA病毒特异性引物扩增序列。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA病毒为重组腺病毒，所述特异性引物对的核酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

11.权利要求9或10所述的试剂盒在检测DNA病毒感染滴度中的用途，其中，所述DNA病毒为重组腺病毒。