[发明专利]一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种检测新型冠状病毒covid-2019的RNA探针，其特征在于，所述RNA探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的RNA探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)引物设计与合成：根据covid-2019待测区域核苷酸序列设计合成上游引物和下游引物；

2)构建重组载体：将所述covid-2019待测区域的核苷酸序列插入至表达载体中，得到带有covid-2019待测区域核苷酸序列的重组载体；

3)PCR扩增：利用步骤1)合成的上游引物和下游引物PCR扩增所述重组载体，所得PCR扩增产物纯化后得到covid-2019待测区DNA片段；

4)体外转录：以所述covid-2019待测区DNA片段为模板进行体外转录，合成反义RNA探针。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述上游引物为COVID-19-F1，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物为COVID-19-R1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述covid-2019待测区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述表达载体为pcDNA3.1-myc-HisA载体，所述重组载体为pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19。

5.权利要求1所述的RNA探针在制备检测新型冠状病毒covid-2019的试剂盒或试剂中的应用。

6.一种非诊断治疗目的检测新型冠状病毒covid-2019的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)杂交预处理：取待测样本进行预处理；

(2)预杂交：将预杂交液加入到处理后的样本中，进行孵育；

(3)杂交：除去预杂交液，将待测样本和杂交液混合，进行孵育；

(4)杂交后处理：除去杂交液，将孵育后的RNA探针回收，漂洗待测样本后和阻断溶液混合，孵育得到杂交样本；

(5)显色、照相：将杂交样本加入到含有终体积分数为1％的羔羊血清的MABT溶液中，清洗后再以MABT溶液清洗，然后以检测缓冲液清洗；加入AP底物染色缓冲液进行室温孵育，包裹避光，当待测样本着色出现后，用PBS溶液清洗，显微镜观察，照相；

步骤(4)所述RNA探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)所述杂交预处理是指将待测样品经蛋白酶K消化后，经PBST溶液漂洗后经多聚甲醛固定，再用PBST溶液漂洗。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述预杂交液用量200ul由以下成分构成：体积比50％的甲酰胺、5×SSCT、50μg/mL肝素、pH值8.0的5mM EDTA、50μg/mL核糖体RNA、1.84％V/V 1M柠檬酸和0.1％V/VTween。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)所述杂交液用量200μL，由所述预杂交液用量200ul和所述检测新型冠状病毒covid-2019的RNA探针混合构成，其中所述RNA探针终浓度为2ng/μL。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤5)所述AP底物染色缓冲液包括4.5μL/mL NBT，3.5μL/mL BCIP和4μL/mL左旋咪唑；所述检测缓冲液为每50mL溶液包含以下成分：100mM NaCl、50mM MgCl₂、100mM三羟甲基氨基甲烷Tris-HCl、1mM 0.1％Tween-20和1mM左旋咪唑。