[发明专利]重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用，所述重组顶头孢霉工程菌是通过敲除顶头孢霉菌基因组上的Acaxl2基因所得。本发明通过构建Acaxl2基因缺陷的重组顶头孢霉工程菌，来促进节孢子的形成，从而达到提高头孢菌素产量的目的。

技术领域

本发明涉及基因工程菌及其应用，具体涉及一种重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)是工业生产头孢菌素的原料，头孢菌素是一类具有重要应用价值的广谱抗生素。头孢菌素C是顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)产生的一类次级代谢产物，顶头孢霉培养过程中的主要形态是分生孢子与节孢子，两者在无性周期中有规律地发生。其中，分生孢子由盘状的分生孢子梗簇中的小梗形成，常在固态培养时出现，而节孢子则是液体培养过程中，养分供应的限制后，溶胀的基质菌丝分裂产生。有文献表明，在顶头孢霉菌生产培养过程中发现，节孢子的分化与头孢菌素C生物合成的最大速率相吻合。节孢子的形成似乎与头孢菌素C的高产有关(请参见文献Nash C H,Huber FM.Antibiotic Synthesis and Morphological Differentiation of Cephalosporiumacremonium[J].Applied microbiology,1971,22(1):6-10.和Bartoshevich Y E,Zaslavskaya P L,Novak M J,et al.Acremoniumchrysogenum differentiation andbiosynthesis of cephalosporin[J].Journal of Basic Microbiology[J].Journal ofBasic Microbiology,1990,30(5):313-320.)。在许多工业生产中，也往往将菌丝形态与CPC产量高低进行关联(请参见文献万平,冀志霞,储炬等.菌丝形态分化与头孢菌素C合成的关系[J].微生物学通报,2005,032(001):15-21.)。但对于节孢子产生与CPC产量之间关联机制的研究，相关文献报道较少。

近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术的普及，极大地提高了人类对于不同物种中遗传物质改造的可操作性。这为利用基因工程手段定向改造顶头孢霉菌提供了良好的技术基础。

发明内容

本发明提供一种重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用，旨在得到一种生产头孢菌素能力较高的顶头孢霉菌。

为解决上述问题，第一方面，本申请提供一种重组顶头孢霉工程菌，其特征在于，所述重组顶头孢霉工程菌是通过敲除顶头孢霉菌基因组上的Acaxl2基因所得，所述Acaxl2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一些实施例中，所述顶头孢霉菌为顶头孢霉1-D1工业菌株。

在一些实施例中，所述敲除所述顶头孢霉菌基因组上的Acaxl2基因为将所述顶头孢霉菌基因组上的Acaxl2基因替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的egfp基因。

在一些实施例中，所述重组顶头孢霉工程菌在发酵中后期至发酵结束，直径为2-8μm的节孢子的含量为70％至95％。

第二方面，本申请提供一种重组顶头孢霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括步骤：

1)构建pAN7-Acaxl2基因敲除载体；

2)构建同源修复片段；

3)将步骤1)所述pAN7-Acaxl2基因敲除载体和步骤2)所述同源修复片段共转化至顶头孢霉菌中，获得产头孢菌素C的重组顶头孢霉工程菌。

在一些实施例中，所述步骤1)中的构建pAN7-Acaxl2基因敲除载体包括步骤：