[发明专利]肠球菌的恒温核酸同步放大检测方法及其专用检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种肠球菌的恒温核酸同步放大检测方法及其专用检测试剂盒，属于生物技术方法领域。本发明提供的试剂盒包括核酸提取液、检测液a、检测液b和SAT酶液，通过分步添加各组分进行反应可以实现对肠球菌快速、准确检测，并且特异性好，灵敏度高，扩增产物RNA易于降解，不会由于检测引起样本交叉污染或环境污染，并且具有对仪器设备要求低和成本低的优点，大大降低了对肠球菌检测的成本。

技术领域

本发明属于生物技术方法领域，具体涉及一种肠球菌的恒温核酸同步放大检测方法及利用RNA的探针法恒温核酸同步放大检测方法(Probe Sequence Amplification andTest，pSAT)检测肠球菌的专用检测试剂盒。

背景技术

船舶压载水中含有细菌等大量微生物，其中一部分会随着压载水转移入新的地理性隔离水域，成为外来入侵种，威胁到这些海湾、河口或内陆水域的生态系统结构及其物种多样性，其中有害的病原菌甚至可能导致当地物种的灭绝。近年来香港多次发生有压载水传播细菌造成红潮，使鱼、贝类感染并导致当地居民食物中毒事件。随着国际航运产业不断壮大，以及人们对海洋环境保护意识的不断增强，船舶压载水的排放所带来的外来海洋生物入侵问题引起了社会各界的广泛关注。

肠球菌(Enterococcus.En.)是拟杆菌门肠球菌科肠球菌属的病原微生物，大小约0.6～2.0μm×0.6～2.5μm，为圆形或椭圆形单个或成对或短链状排列的革兰氏阳性球菌，无芽胞，无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。肠球菌属包括粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌、酪黄肠球菌等13个种，广泛分布于自然环境及人和动物消化道内，肠球菌除了作为医院感染的重要病原菌，环境中肠球菌的监测也尤为重要，而食品和水中肠球菌检验早在2007年就已列入出入境检验检疫中。

传统的肠球菌检测通常采用琼脂平板培养法，这种方法主要依靠培养基进行培养、分离及生化鉴定，操作过程繁杂且费时费力，一般需2-3天才能完成，无法适应快速检测的要求。杜邦、梅里埃、默克等国际跨国公司在微生物快速检测市场投入巨资，分别研制了如和等快速检测系统，对微生物污染进行准确、快速和标准化的检测，自动化同步完成任何微生物的基因鉴定和分子分型，实现环境、设备、人员等各个生产环节上全方位的微生物风险评估和污染溯源。例如CN110760600A公开一种采用Q-PCR技术测定肠球菌的快速检测方法，虽然其缩短了检测时间且克服了传统平板培养方法检测肠球菌操作繁琐、耗时耗力的问题，并提高了鉴别的准确度，但是该文献公开的方法的扩增产物为DNA，由于DNA难于降解会造成样本交叉污染或环境污染，并且该PCR方法对反应设备有较高要求，使用的设备价格较高，会大大增加国内相关企业检测成本。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明提供一种肠球菌的恒温核酸同步放大检测试剂盒，其包括：

(1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针A的固相支持物和探针B，其中，

所述捕获探针A用于捕获检测序列，

所述探针B的3’端序列为与靶标序列特异性结合的序列，5’端序列为第一引物的序列，所述第一引物的5’端为启动子序列，3’端序列为与靶标序列不同源的序列；

(2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与靶标序列的互补序列特异性结合；

(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标序列的转录RNA特异性结合；

(4)SAT酶液：其包含至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶和逆转录酶。

上述试剂盒还包括：

(5)样品保存液，其包含高浓度去垢剂；

任选地，所述试剂盒还包括：

(6)En外标，其为含有系列稀释浓度肠球菌的菌液；