[发明专利]一种衰老过程中心肌纤维化的生物标志物及其检测方法和应用

说明书

本发明第一方面涉及一种衰老过程中心肌纤维化的生物标志物，所述生物标志物为甲基化的基质金属蛋白酶9基因。本发明第二方面涉及一种检测如前所述生物标志物的方法，步骤包括：S1、采用EDTA真空抗凝采血管采集待测者的外周静脉血，分离上层血浆，提取血浆白细胞DNA；S2、对所述DNA进行简并代表性亚硫酸盐测序检测，然后对所述测序结果进行亚硫酸氢盐扩增子测序验证；S3、对基质金属蛋白酶9基因位点：chr20:44641083，chr20:44641088和chr20:44639200中C‑G位点的甲基化频率进行高精度分析。本发明的第三方面是提供一种如前所述生物标志物在制备房颤筛查试剂盒中的应用。本发明通过检测样品中MMP9的甲基化频率可以辅助判断待检者在衰老过程中罹患房颤的可能性大小，早期有效地识别发生房颤的高危患者。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种衰老过程中心肌纤维化的生物标志物及其检测方法和应用。

背景技术

心房颤动(房颤)是临床上最常见的心律失常之一，流行病学研究结果提示：房颤是衰老相关的疾病，其发病率随着年龄的增长而增加。房颤可导致心力衰竭，也是引起缺血性脑卒中的重要原因之一，且与其他原因的缺血性脑卒中相比，房颤导致的缺血性脑卒中致残率及致死率更高，社会危害极大。由此可见：房颤已成为当前老龄化社会面临的严重公共健康问题。目前认为房颤形成的核心机制主要与心房组织结构重构的基础上进而出现电学异常有关，而心肌纤维化在这过程中发挥关键作用。

最近的一系列证据表明，调控表观遗传机制可能是衰老相关基因表达调控的主要方式。DNA甲基化是表观遗传调控中研究得最早，也是最重要的一种修饰方式，它参与了基因/环境间复杂的相互作用，同时也是衰老过程中的标志性事件。富含C-G岛的基因启动子区作为甲基化发生的主要区域，DNA序列中的腺嘌呤或胞嘧啶碱基在DNA甲基化转移酶的催化下与甲基发生共价结合，甲基化水平改变后引起基因转录受到抑制或促进，导致蛋白表达量的改变。另外，DNA甲基化序列是以一种高度稳定的形式存在于细胞中，针对外周血检测相关基因DNA甲基化改变成为研究相关疾病表观遗传学调控机制的重要方法。而DNA甲基化本身就是心肌纤维化维持的重要机制。不同疾病和病理改变中存在不同的DNA甲基化谱，通过识别DNA异常甲基化谱并有效构建特异文库可作为潜在的分子生物标志物用于心肌纤维化的诊断。

基质金属蛋白酶9(MMP9)，是基质金属蛋白酶超家族成员中明胶酶的一种，可分解胞外基质(ECM)并导致基质性质改变和组织重构，是机体中调控结缔组织成形、损伤修复中重要的酶。同时MMP9在房颤患者心房组织中高表达，作为房颤发生的独立因素，并且在心房结构重构和房颤发病中起到重要作用。

由于基因异常甲基化是疾病发生过程的早期事件，识别并构建甲基化谱文库对于房颤早期诊断和预后具有重要的应用价值，尤其是识别外周血中纤维化特异性DNA甲基化谱更是为寻找无创性房颤诊断标志物提供了线索。由于DNA甲基化可以通过外源药物逆转，因而该研究结果也具有潜在的治疗应用前景。

传统的心肌纤维化的监测金标准为心肌组织活检，但由于此类有创操作风险较高，在临床上很少采用。其他检测方法包括血液心肌纤维化标志物检测、心脏超声、磁共振等。其中血液纤维化标志物监测容易受饮食等多种因素影响，特异性低；心脏超声其敏感性和特异性均比较低；磁共振检查结果可靠，但存在费用高昂等缺点。为此，寻找快速、简便、灵敏、特异、经济的诊断方法成为当前衰老相关房颤防治监测工作中的一项重要任务。DNA甲基化改变常常是衰老过程中心肌纤维化的关键性早期改变，如果能够建立合理的多指标的DNA甲基化图谱，在病理改变的早期阶段即采用分子生物学技术识别出这种特异性变化，无疑对实现衰老过程中房颤的预防和诊治都将具有极重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种衰老过程中心肌纤维化的生物标志物及其检测方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：