[发明专利]RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的引物、探针、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种RPA‑LFD可视化快速检测血吸虫核酸的引物、探针、试剂盒及方法，引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。本发明以SjCHGCS19基因为靶序列设计了RPA引物及探针，并采用RPA扩增技术结合侧流层析试纸条法，实现了血吸虫核酸的敏感、快速可视化检测。本发明中的检测方法对日本血吸虫基因组DNA检测限可达1fg并有望用于曼氏血吸虫及埃及血吸虫的通用检测，该方法可检出感染早期小鼠血清中血吸虫循环核酸，操作简单且快速，无需特殊仪器，反应温度与室温接近，可肉眼观察结果，有利于实现现场血吸虫中间宿主的早期敏感快速检测，及血吸虫病传播风险高危环境的及时敏感监测。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种RPA-LFD可视化快速检测血吸虫循环核酸的引物、探针、反应体系、试剂盒及检测方法。

背景技术

血吸虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病，流行于全球78个国家和地区，被WHO列为极易复现的被忽视热带病之一。中国仅流行日本血吸虫病，经过70年的积极防治，我国血吸虫病感染率及感染度已降低至历史极低水平。同时，随着全球一体化进程的提速，人员流动愈发频繁，境外输入性血吸虫病病例不断出现，已成为我国血吸虫病防治工作面临的新挑战及新困难。新形势下，现有病原学及免疫学诊断技术在血吸虫检测敏感性、早期检测及输入性血吸虫鉴别检测方面的弊端日趋明显，尚不足以满足消除阶段对血吸虫病疫情及时、敏感及有效监测的需求。近年来，检测血吸虫特异核酸序列的多种分子诊断方法已有诸多报道，展示了核酸检测在血吸虫感染检测中的应用价值。然而，这些方法大多基于PCR、巢式PCR、实时定量PCR及数字PCR等，其敏感性及特异性方面虽具有优势，但因大多依赖昂贵的仪器设备、操作繁琐、耗时较长等特点，一定程度上限制了其推广应用，因此迫切需要探索更为简便的核酸检测方法用于血吸虫病的检测与监测。

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)技术，是近年来备受关注且迅速发展的等温扩增技术，其依据T4噬菌体核酸复制机制，利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的作用，实现目的基因的扩增。已有文献中关于日本血吸虫核酸检测技术的诊断应用价值Meta分析结果提示，等温扩增技术的诊断效能优于依赖变温扩增设备的PCR类技术；等温扩增技术中，RPA又具有明显的诊断优势。然而目前报道的基于RPA或RAA的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)核酸检测方法大多以日本血吸虫非长末端重复序列反转录转座子(Schistosoma japonicum non-long terminal repeatretrotransposons，SjR2)片段为靶标，其特异性较好，但敏感性不够理想，且需借助相应的仪器，不适宜基层应用。本课题组前期以SjR2序列为靶标，建立了基于RPA技术的电化学DNA传感器检测方法，其敏感性虽高，但仍需借助一定的检测设备，限制了其在现场的推广应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种可视化快速检测血吸虫核酸的检测方法，该方法具有敏感性高、检测快速、简单便携、无需借助昂贵仪器即可肉眼观察检测结果、适用于实验室及现场血吸虫病的早期诊断、鉴定和筛查的特点。

为解决上述技术问题，本发明根据登录号为FN356221.1的日本血吸虫SjCHGCS19基因序列，设计并提供了以下技术方案。

第一方面，本发明提供一对RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的特异性RPA引物，所述RPA引物的核苷酸序列为：

上游引物RPA-PF:5'-AAGACAATGAAGAAGGGGATTACAATGAAC-3'(如SEQ ID NO.1所示)；

下游引物RPA-PR:5'-BIOTIN-AGTGTTGTCCATTCCGACTTTGGCATTTAG-3'(如SEQ IDNO.2所示)。

作为一个优选的实例，所述引物中，下游引物(RPA-PR)的5'端为生物素化修饰。