[发明专利]RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的引物、探针、试剂盒及方法

权利要求书

1.一对RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：

上游引物：5'-AAGACAATGAAGAAGGGGATTACAATGAAC-3'；

下游引物：5'-Biotin-AGTGTTGTCCATTCCGACTTTGGCATTTAG-3'。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述下游引物的5'端为生物素化修饰，所述一对引物所扩增的特异性片段为日本血吸虫非长末端逆转录转座子SjCHGCS19的第474-656bp间的序列，大小为183bp，扩增序列为：

AAGACAATGAAGAAGGGGATTACAATGAACATCATCCAGTGTTATGCACCCACCAACGACGGCAACGACGAGGACAAAGATCAGTTTTATGATAGGCTTCAGTCAATTATAGCGAAGTGTCCAGGAAAGGATCTGACAATCCTGATGGGGGACCTAAATGCCAAAGTCGGAATGGACAACACT。

3.一种RPA-LFD可视化检测血吸虫核酸的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：

5'-FAM-CTTAAAGCGAGGGAGAGCGGCAGGACCAGATG[THF]ATTGACCCCTGAGATAT-ph-3'，

其中，FAM表示5'端为荧光素修饰，THF表示第33个碱基为四氢呋喃残基，ph表示3'为磷酸基团封闭。

4.一种RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的引物与探针的组合，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：

上游引物：5'-AAGACAATGAAGAAGGGGATTACAATGAAC-3'；

下游引物：5'-Biotin-AGTGTTGTCCATTCCGACTTTGGCATTTAG-3'；

所述探针的核苷酸序列为：

5'-FAM-CTTAAAGCGAGGGAGAGCGGCAGGACCAGATG[THF]ATTGACCCCTGAGATAT-ph-3'。

5.如权利要求4所述的引物与探针的组合用于制备成RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的试剂盒的应用。

6.一种RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如SEQ ID NO.1～2所示的引物对，和如SEQ ID NO.3所示的探针。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RPA扩增反应体系试剂；所述RPA扩增反应体系试剂包含：RPA反应缓冲液、RPA扩增试剂、醋酸镁、双蒸水；其中，所述RPA扩增试剂的组分包括：噬菌体重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及核酸外切酶。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条。

9.一种非诊断目的的RPA-LFD可视化检测日本血吸虫核酸的方法，其特征在于，包括步骤：

1)提取待测样本中的总DNA；

2)RPA扩增：将如SEQ ID NO.1～2所示的RPA引物对、如SEQ ID NO.3所示RPA-nfo探针、RPA反应缓冲液、总DNA模板及醋酸镁混合于含RPA扩增试剂的反应管中配置成RPA反应体系，反应温度设为30～45℃，反应时间为10～30min，进行RPA扩增；以双蒸水为阴性对照，以血吸虫基因组DNA为阳性对照；

3)LFD检测RPA扩增产物：采用侧流层析试纸条检测RPA扩增产物，将扩增产物稀释后，滴加于侧流层析试纸条的样品垫上，然后将样品垫垂直插入稀释液中，室温反应5-10min，肉眼观察结果。