[发明专利]用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒

说明书

本发明提供了用于α‑地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒，属于分子生物学检测技术领域；所述引物、探针和反应缓冲液组合包括8组引物和探针组合以及4种反应缓冲液；所述4种反应缓冲液包括B‑4反应缓冲液、B‑2反应缓冲液、J‑1反应缓冲液和H‑1反应缓冲液。本发明的引物、探针和反应缓冲液组合实现‑‑supgt;SEA/supgt;、‑‑supgt;THAI/supgt;、‑αsupgt;3.7/supgt;、‑αsupgt;4.2/supgt;长片段缺失的扩增，以及和αsupgt;CS/supgt;α/αα、αsupgt;QS/supgt;α/αα、αsupgt;WS/supgt;α/αα三种非缺失型同步分型检测扩增，该方法具有特异性强，灵敏度高，耗时短等特点，同时拥有同一个反应管中通过不同荧光通道进行区分不同突变型的特点。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒。

背景技术

α-地中海贫血是由位于人类16号染色体末端的α-珠蛋白基因缺陷所致，可划分为缺失型和非缺失型两大类，其中，缺失型发病率远高于非缺失型。α-地中海贫血属于常染色体单基因遗传病,高发于我国南方特别是华南、西南等地区,中国人群主要为右侧缺失型(-α^3.7)，左侧缺失(-α^4.2)，和东南亚型(--^SEA)三种缺失型、α^CSα/αα、α^QSα/αα、α^WSα/αα三种非缺失型以及散发病例泰国缺失型(--^THAI)等α-地中海贫血基因型。-α^3.7型主要缺失的是α1基因，缺失片段长3.7Kb；-α^4.2型缺失的是α2基因，缺失片段长4.2Kb；而--^SEA两个功能基因即α1，α2全部缺失，缺失片段长达20Kb。--^THAI缺失片段比--^SEA缺失的片段还要长，缺失片段包括α1，α2基因，在临床上可以形成中重度α地中海贫血。α^CSα/αα、α^QSα/αα、α^WSα/αα三种点突变均位于α2珠蛋白基因上。

临床上将α-地中海贫血患者划分为4型：即静止型、轻型、标准型即HbH病(血红蛋白病)，以及重型(巴氏水肿胎儿，Bart's fetus)。静止型又称为地中海贫血2或α+-地中海贫血，基本无症状，无明显血液学改变，是缺失一个α-基因的携带者。轻型又称为α-地中海贫血1或α0-地中海贫血，有轻微贫血症状，表现为轻度贫血，多是因缺失2个α基因所致。中间型(HbH病)是临床上最常见的α-地中海贫血类型，有明显的甚至严重的贫血症状，患儿从1岁左右即出现贫血，严重者肝脾肿大及黄疸，面黄肌瘦并伴骨骼变化，靠输血维持生命。HbH病患者共缺失或相当于缺失三个α基因。重型地贫是最严重的一种，是α0地贫的纯合子状态，其4个α珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α链生成，胎儿生下来就是死胎。目前，本病尚无有效治疗方法，只有通过遗传咨询、产前基因诊断来杜绝地中海贫血患儿出生，以达到优生的目的。

目前市场上用于α地中海贫血基因检测的试剂盒最常见的方法为缺口PCR(gap-PCR)技术和反向点杂交技术(RDB)。

Gap-PCR技术是设计与缺失序列两侧序列互补的引物，缺失使本来在正常DNA序列中相距很远的这对引物之间的距离因断端连接而靠近，并能扩增出特定长度的片段。再通过琼脂糖凝胶电泳，根据电泳片段大小检测样品的基因型，是缺失型地中海贫血检测的有效方法，但是该方法只能检测出α地贫中的缺失型。

RDB技术是在PCR扩增的基础上，将PCR产物与固定在膜条上的特异性探针杂交，再通过激发荧光或一系列显色反应观察结果，该方法灵敏度高，但是该方法只能检测出非缺失型地中海贫血。