[发明专利]用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒

权利要求书

1.用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的试剂盒，由用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合而成，所述组合包括8组引物和探针组合以及4种反应缓冲液；所述4种反应缓冲液包括B-4反应缓冲液、B-2反应缓冲液、J-1反应缓冲液和H-1反应缓冲液；所述8组引物和探针组合包括第1组引物和探针组合～第8组引物和探针组合；所述第1组引物和探针组合～第8组引物和探针组合分别单独包装；所述B-4反应缓冲液、B-2反应缓冲液、J-1反应缓冲液和H-1反应缓冲液分别单独包装；

所述第1组引物和探针组合包括：SEA上游引物、SEA下游引物、SEA探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述SEA上游引物、SEA下游引物和SEA探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；

第2组引物和探针组合包括：THAI上游引物、THAI下游引物、THAI探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述THAI上游引物、THAI下游引物和THAI探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；

第3组引物和探针组合包括：4.2A上游引物、4.2A下游引物、4.2A探针、内标03上游引物、内标03下游引物和内标03探针；所述4.2A上游引物、4.2A下游引物和4.2A探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9所示；所述内标03上游引物、内标03下游引物和内标03探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.34～SEQ ID NO.36所示；

第4组引物和探针组合包括：4.2B上游引物、4.2B下游引物、4.2B探针、内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针；所述4.2B上游引物、4.2B下游引物和4.2B探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12所示；所述内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.33所示；

第5组引物和探针组合包括：3.7上游引物、3.7下游引物、3.7探针、内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针；所述3.7上游引物、3.7下游引物和3.7探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15所示；所述内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.33所示；

第6组引物和探针组合包括：WS上游引物、WS下游引物、第一WS探针、第二WS探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述WS上游引物、WS下游引物、第一WS探针和第二WS探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.19所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；

第7组引物和探针组合包括：QS上游引物、QS下游引物、第一QS探针、第二QS探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述QS上游引物、QS下游引物、第一QS探针和第二QS探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.23所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；

第8组引物和探针组合包括：CS上游引物、CS下游引物、第一CS探针、第二CS探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述CS上游引物、CS下游引物、第一CS探针和第二CS探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.27所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；

所述SEA探针、THAI探针、4.2A探针、4.2B探针、3.7探针、第二WS探针、第二QS探针和第二CS探针的5’端分别标记有荧光报告基团FAM，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；

所述第一WS探针、第一QS探针和第一CS探针的5’端分别标记有荧光报告基团ROX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ2；

所述内标01探针、内标02探针和内标03探针的5’端分别标记有荧光报告基团HEX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；

所述B-4反应缓冲液包括以下浓度的组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.8mM、三羟甲基氨基甲烷32.2mM、氯化钾150mM、氯化镁6.25mM、曲拉通0.25％、硫酸铵12.5mM、脱氧核糖核苷三磷酸0.75mM和脱氧尿苷三磷酸1.5mM；

所述B-2反应缓冲液包括以下浓度的组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.8mM、三羟甲基氨基甲烷32.2mM、氯化钾150mM、氯化镁6.25mM、曲拉通0.25％、硫酸铵12.5mM、四甲基氯化铵20mM、脱氧核糖核苷三磷酸0.75mM和脱氧尿苷三磷酸1.5mM；

所述J-1反应缓冲液包括以下浓度的组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.8mM、三羟甲基氨基甲烷32.2mM、氯化钾125mM、氯化镁6.25mM、硫酸铵25mM、体积百分含量为12.50％的二甲基亚砜、甜菜碱2.5M、7-deaza-dGTP0.075mM、脱氧核糖核苷三磷酸1mM和脱氧尿苷三磷酸2mM；

所述H-1反应缓冲液包括以下浓度的组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸50mM、硫酸铵25mM、氯化钾125mM、氯化镁7.5mM、体积百分含量为2.50％的甲酰胺、脱氧核糖核苷三磷酸0.4mM和脱氧尿苷三磷酸0.8mM；

所述第1引物和探针组合～第3引物和探针组合分别和B-4反应缓冲液联用；

所述第4引物和探针组合和B-2反应缓冲液联用；

所述第5引物和探针组合和J-1反应缓冲液联用；

所述第6引物和探针组合～第8引物和探针组合分别和H-1反应缓冲液联用；

所述试剂盒还包括酶混合液、稀释缓冲液、TE缓冲液和石蜡油；

所述试剂盒的每组引物和探针组合中，每种引物或者每种探针的使用母液浓度分别为50μM。