[发明专利]一种啤酒酵母中过表达芳香氨基酸转氨酶II Aro9的构建方法

说明书

本发明旨在构建一种过表达芳香族氨基酸转氨酶ⅡAro9的啤酒酵母菌种，包括以下步骤：(1)菌体培养及啤酒酵母基因组的获得：首先将啤酒酵母TCCC 31194划三区培养，然后用SDS处理菌体获得啤酒酵母基因组；(2)目的基因片段的获取：设计合理的同源引物，通过PCR技术扩增出Aro9(S.c)、Aro9(S.b)目的基因；(3)基因过表达组件的构建：以pYPGE15质粒为载体，构建pYPGE15_KanMX_Aro9(S.c)、pYPGE15_KanMX_Aro9(S.b)表达载体；(4)获得重组菌株：将pYPGE15_KanMX_Aro9表达载体转入啤酒酵母TCCC 31194中，得到TCCC 31194::Aro9(S.c)、TCCC 31194::Aro9(S.b)的重组酵母；(5)啤酒发酵：将转化成功的酵母菌种在适宜条件下培养10天；(6)三醇四酯、芳香醇和芳香氨基酸含量及相关发酵性能检测。

技术领域

本发明属于基因工程领域，主要介绍了构建一种啤酒酵母中过表达芳香氨基酸转氨酶II Aro9的重组体系，从而达到改善啤酒中三醇四酯、芳香醇和芳香氨基酸含量的目的。

背景技术

高级醇作为啤酒中主要的风味物质，对于啤酒整体风味的形成至关重要。高级醇又称杂油醇，指含3个碳原子以上的醇类，适量的高级醇可使啤酒口感柔和协调，酒体圆润醇厚，但是如果啤酒中高级醇含量过高则会带有不愉快的苦味。通常异戊醇是啤酒中含量最高的高级醇，超量的异戊醇和异丁醇会使啤酒具有异杂味，过量的戊醇有汗臭味和腐败味，正丙醇则具有刺激性酒精味，含量偏低则会使啤酒口味寡淡，气味不协调、口感不柔和；含量偏高则会带来强烈的酒精刺激味，所以如何控制高级醇含量是啤酒酿造过程中应该着重考虑的问题。

芳香醇是啤酒高级醇类物质中为啤酒的芳香风味有重要贡献的一类风味物质，包含苯乙醇、酪醇和色醇三种：其中苯乙醇带有清甜的玫瑰花香气，而酪醇和色醇带有苦味。在酵母的代谢通路中芳香醇通常由艾利希途径和从头合成两种方式进行合成，而艾利希途径中的芳香氨基酸转氨酶是一个重要的调控环节，其中控制芳香氨基酸转氨酶II的基因Aro9有着至关重要的作用。研究所使用的的啤酒酵母为自然条件下酿酒酵母和贝式酵母杂交所产生的Lager酵母，是一种异源多倍体菌种，其遗传背景较前二者更为复杂。本发明即对芳香氨基酸转氨酶II Aro9基因进行过表达，增加其拷贝数，从而研究啤酒酵母中所含的Aro9(S.c)支路、Aro9(S.b)支路对芳香醇和芳香氨基酸合成所产生的影响。

在酵母代谢的过程中，艾利希途径包括氨基酸生成相应的醇，在最初的转氨作用反应中，酵母在α-酮酸被释放到细胞外之前，通过艾利希途径将其转化为高级醇或酸。我们所研究的芳香氨基酸转氨酶II基因Aro9参与艾利希途径的第一步转氨反应，将氨基酸转化为相应的酮酸。

发明内容

本发明的目的在于构建一种过表达芳香氨基酸转氨酶II基因Aro9的重组啤酒菌株。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

(1)菌体培养及啤酒酵母基因组的获得：首先将啤酒酵母TCCC 31194划三区培养，直至生长出单克隆，选取长势良好的单克隆平涂在平板上培养获得大量菌体，然后用SDS处理菌体获得啤酒酵母基因组；

(2)目的基因片段的获取：设计合理的同源引物，通过PCR技术扩增出Aro9(S.c)、Aro9(S.b)目的基因；

(3)基因过表达组件的构建：以pYPGE15质粒为载体，将KanMX基因插入其中，同时将Aro9(S.c)、Aro9(S.b)基因分别插入启动子PGK下游的BmaH I酶切位点处，构建pYPGE15_KanMX_Aro9(S.c)、pYPGE15_KanMX_Aro9(S.b)表达载体；