[发明专利]DAβ42及其表达载体、DAβ42的制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于建立AD疾病模型的DAβ42及其重组质粒表达载体，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明还公开了上述DAβ42的制备方法，本发明将来源于人类AD疾病中的毒性蛋白Aβ42进行修饰改造后构建成Aβ42二串体的原核重组，构建表达质粒，经表达、纯化，可大量获得能够诱导神经细胞和实验动物发生AD样毒性的二串体蛋白，且制备成本低、活性高。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种DAβ42，还涉及上述DAβ42的表达载体和制备方法，还涉及上述在体内、外研究中利用DAβ42建立AD疾病模型中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种典型的神经退行性疾病，在所有的痴呆病例中，AD占70％，年龄是AD发病的一个高风险因素。近年来，随着全球人口老龄化趋势加快，AD发病率也呈现出大幅度的增加。据《世界阿尔茨海默病报告2018》报道，2018年全世界共有5000万痴呆病患，因此，关于AD的诊疗研究对患者及其家庭、社会都有重要意义，是亟待解决的一个全球性的医疗卫生问题。

在AD患者大脑中存在这两种典型病变：由淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成的淀粉样斑块和由过度磷酸化的Tau蛋白聚集形成的神经纤维缠结。关于Aβ聚集和Tau过度磷酸化在AD发病过程中发挥的作用，孰轻孰重、谁先谁后，研究界一直有不同的观点。但不管是哪一种观点，都不能否认Aβ在AD发病过程中的关键作用。而大量的相关研究也表面，Aβ在体内和体外都可以对神经细胞产生AD样的毒性作用，如Tau过度磷酸化和氧化应激反应，以及突触障碍和神经元损伤等等。因此，Aβ是AD研究的一个重要分子，无论在体内和体外都可以用来模拟AD的发病过程，为AD诊疗研究提供良好的实验模型。

Aβ是存在与人脑中的一种蛋白，是由39-43个氨基酸组成的一系列不同大小的肽段。Aβ由其前体蛋白APP经酶切作用产生，在病理情况下，由42个氨基酸组成的Aβ42在大脑中的含量增加；而Aβ42的自聚能力很强，最终形成二串体、寡聚体、纤维和斑块等聚集程度不同的产物。因此，Aβ42是主要的毒性物质，但是其聚集至何种程度毒性最大，一直是一个有争议的问题。之前的研究认为寡聚体是发挥毒性的主要物质，但是到底几条肽段的聚合物有毒性最大，研究界一直没有答案。

商品化Aβ42是通过化学合成的单体，在使用之前需通过一系列复杂的操作预处理才可以得到有毒性的聚合物。然而，此聚合物中包含有不同数量单体组成的多聚体，而具体是哪种聚合物发挥毒性尚未可知。而且通过化学合成Aβ十分昂贵，操作过程复杂且不稳定。

在我们前期的研究中，我们通过原核表达了Aβ42的二串体(Dipolymer Aβ42,DAβ42)，将这些表达产物与商品化的Aβ42等剂量诱导AD疾病模型，发现DAβ42建模效果最佳。

发明内容

本发明的目的是提供一种DAβ42的制备方法。

本发明的第二个目的是提供一种用于表达DAβ42的重组表达载体。

本发明所采用的第一种技术方案为一种DAβ42的制备方法，按照以下步骤具体进行：

步骤1、从Genebank获取Aβ42cDNA序列，序列SEQ ID No.2所示；

步骤2、通过原核密码子系统优化Aβ42cDNA序列，所述序列的两端含有Nco I和XhoI的酶切位点，序列如SEQ ID No.3所示；

步骤3、将步骤2得到的优化后的DAβ42cDNA片段克隆到pUC57载体中，得到pUC57-DAβ42重组载体；

步骤4、将步骤3得到的pUC57-DAβ42重组载体转化入DH5α大肠杆菌，扩增pUC57-DAβ42重组载体，通过克隆筛选成功转入pUC57-DAβ42重组载体的DH5α大肠杆菌；