[发明专利]肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂

说明书

本发明涉及病原检测技术领域，尤其涉及肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂。本发明提供的肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂添加了抗抑制的成分，可以耐受抑制物胆酸盐、血红素的干扰，并且该试剂能够于2～8℃稳定保存，避免了‑20℃冻存的苛刻条件，从而使反应前无需解冻，提高了反应效率。将该试剂制成试剂盒，适用于更多的样本类型，如咽拭子、粪便、疱疹液、肛拭子。该试剂盒通用性引物覆盖更多的血清型，包括柯萨奇A组、B组、肠道病毒71型，埃可病毒。该试剂盒具有良好的灵敏度、特异性、重复性。

技术领域

本发明涉及病原检测技术领域，尤其涉及肠道病毒EV71、CA16、EV通 用型核酸检测试剂。

背景技术

肠道病毒(enterovirus，EV)属于小RNA病毒科肠道病毒属，能引起人 类致病的肠道病毒有多种，包括人肠道病毒A、B、C、D组，有100多个血清 型，人对人肠道病毒普遍易感，不同年龄组均可感染发病，以5岁及以下儿 童为主，尤以3岁及以下儿童发病率最高，占发病数85％～95％。肠道病毒以 上呼吸道、咽喉和肠道为侵入门户，先在局部黏膜和咽、扁桃体等淋巴组织 和肠道集合淋巴结中初步增殖，然后释放入血，形成第一次病毒血症。扩散至带有受体的靶组织，再次增殖后，引起第二次病毒血症和临床症状。为进一步指导医疗机构做好手足口病诊疗工作，根据手足口病诊疗进展，国 家卫生健康委员会办公厅研究制定了《手足口病诊疗指南(2018年版)》和 《中华人民共和国卫生行业标准-手足口病诊断》，适用于全国各级各类医疗 卫生机构及其医务人员对手足口病的诊断。卫生部发布《手足口病预防控制 指南》指导各地做好手足口病的预防控制。

目前，国内对EV的诊断方法主要有病毒分离培养法、血清学检测法和分 子生物学诊断法。病毒分离培养法是EV的实验室诊断常规方法，是检测EV的金标准，即：其利用组织技术从感染部位或传染源分离出病毒病鉴定其特异 性血清型型。病人标本是最常采集的标本，如粪便、咽拭子、疱疹液、脑脊 液和血液等。病毒的分离鉴定繁琐、费力、耗时，一般一周才能观察到细胞 病理反应，而且许多肠道病毒不能进行细胞培养，或者可以培养但不出现细 胞病理效应。血清学检测方法在疾病早期(即病毒“窗口期”)血液中不易 检测到病毒抗体，不适用于早期诊断，可作为回顾性诊断，且由于肠道病毒 血清型众多，临床使用检测价值有限，而多为流行病学采用。分子诊断学方法包括：基因序列测序及核酸检测方法，其中基因序列测序具有成本昂贵， 步骤复杂繁琐，耗时长等缺点，临床检测不适宜使用。但病毒核酸荧光PCR 检测法具有快速性、准确性和高灵敏性等优点，能够对细菌感染作出早期诊 断，适合临床诊断，同时给疫情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。因 此，在国内采用实时荧光PCR技术进行EV检测是最快速、可靠的方法。

目前是市售的荧光PCR试剂必须-20℃冷冻储存，且存在对肠道病毒通用 型型别覆盖偏少、对胆酸盐、血红素等抑制物耐受能力较差、适用样本类型 单一或偏少等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供肠道病毒EV71、CA16、 EV通用型核酸检测试剂，该试剂性质稳定，可于2℃～8℃储存备用。

本发明提供的肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂，其包括 反应液1和反应液2；

所述反应液1包括：Tris-HCl、氯化钾、硫酸铵、叠氮钠、PEG2000和亚 精胺；

所述反应液2包括醋酸镁和叠氮钠。

本发明中，所述反应液1中包括如下浓度的：

本发明中，所述反应液2中，醋酸镁的浓度为2-20mM；叠氮钠的浓度为 0.05wt％～2wt％。

本发明实施例中，所述反应液1中还包括肠道病毒EV71、CA16、EV的 引物和探针。

本发明实施例中，所述特异性引物和探针包括：