[发明专利]一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和提高D-阿洛酮糖的产量的应用

说明书

本发明公开了一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和提高D‑阿洛酮糖的产量的应用，属于酶定向进化技术领域。本发明设计了定向进化的重组质粒，该定向进化的重组质粒便可视作一基因电路，即DTE酶效率的基因电路。与此同时，并本发明还公开了基于上述重组质粒构建得到的重组工程菌，具体为大肠杆菌E.coli DH5αpSB1C3‑psiR‑pPsi‑EGFP‑cp‑kanR‑DTE。本发明的上述基因电路使用阻遏蛋白PsiR与其对应启动子pPsi实现了D‑阿洛酮糖的生物传感器；使得菌体可感应体内D‑阿洛酮糖的生产量以表达不同水平的抗生素抗性基因，从而将DTE酶的效率转化为菌体的生存优势。

技术领域

本发明属于酶定向进化技术领域，涉及一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和提高D-阿洛酮糖的产量的应用。

背景技术

D-阿洛酮糖是天然少量存在的稀有单糖，是果糖的C-3差向异构体。作为一种稀有糖，其口感较好且后味不苦，是一种新型甜味剂。在10％的稀释浓度下， D-阿洛酮糖是蔗糖70％的甜度，但仅有其0.3％的热量。是蔗糖的理想替代物。D-阿洛酮糖可抑制肠道α-糖苷酶与肝脏产脂酶，可抑制脂肪的积累。D-阿洛酮糖具有血糖抑制功能。在饮食中补充阿洛酮糖可缓解餐后血糖升高并增强对胰岛素的敏感性。动物实验也报道了D-阿洛酮糖对于Ⅱ型糖尿病具有保护作用。相比于D-果糖与D-葡萄糖，D-阿洛酮糖还原性更高，更易引发美拉德反应，以调节糕点的颜色并增加风味。D-阿洛酮糖还具有神经保护作用，对于神经退行性疾病具有潜在的医疗价值。在小鼠实验中，D-阿洛酮糖可被小肠吸收，但几乎在体内不被代谢，而随尿液排出。在小鼠实验中，长期施加3％阿洛酮糖喂养并未产生明显的副作用。D-阿洛酮糖在2011年被FDA批准为“GRAS”(通常视为安全)。

由于天然产量极低且化学生产工艺复杂，D-阿洛酮糖的工业生产一般使用生物发酵方法。D-塔格糖差向异构酶(EC 5.1.3.31,D-tagatose-3-epimerase,DTE酶) 家族催化D-果糖与D-阿洛酮糖之间的转化，是工业生产D-阿洛酮糖的关键酶。 DTE酶家族包含数种来源的酶，其最适底物、酶效率、最适pH与温度和金属离子辅因子也各不相同。其中发现最早的来源于Pseudomonas cichorii ST-24菌株，其最适底物为D-塔格糖，因此被命名为DTE酶。随后被发现的来源于 Agrobacterium tumefaciens的DTE酶家族成员特异性催化D-果糖与D-阿洛酮糖之间的转化，被命名为DPE酶(D-阿洛酮糖差向异构酶)。DTE酶家族在Rhodobactersphaeroides SK011，Clostridium cellulolyticum H10等菌株中也被发现与表征。使用未经改造的天然DTE酶以D-果糖为底物生产D-阿洛酮糖，其平衡转化率在30％上下，因此在产率上有较大的提升空间。且天然DTE酶的最适pH 均为弱碱性，但发酵生产D-阿洛酮糖要求酸性环境以减少美拉德反应的发生，因此如何工程改造DTE酶的最适pH也是一重要方向。

合成生物学是一门研究生物系统工程化设计的学科。该学科注重将理性设计、系统建模与工程中的概念，如模块化、标准化设计等引入传统的基因工程。定向进化与生物传感器是合成生物学中两项重要的使能技术。定向进化模仿达尔文式自然选择，用于优化某一特定的生物特性，如某一种酶、某一代谢通路乃至优化整个生命体。定向进化的优势在于对目标系统的知识不充分的情况下优化系统的特性，从而大大加快合成生物学设计、测试、构建这一循环的速度。但定向进化中突变文库的构建方式、表型的呈现方式与筛选通量等往往制约着该技术的应用；如何从一多样化的种群中筛选最适的个体是定向进化的核心问题之一。近年来，合成生物学技术与理念的发展使得研究者得以构建比以往更复杂的工程菌以及工程细胞。随着工程菌或工程细胞复杂度的增加，其中插入的DNA片段，如质粒等也变得更加复杂，且其倾向于由若干已被研究报道的、模块化的DNA片段所组成。因此，这些由合成生物学启示的插入DNA片段或插入质粒往往被形象地称作“基因电路“。