[发明专利]一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法及其应用

说明书

本发明提供一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法及其应用，包括通过CRISPR/CAS9技术敲除小鼠染色体中编码白介素‑2受体的gamma链的基因的步骤，选择白介素‑2受体的gamma链的基因的外显子1和2作为敲除位点，Cas9信使RNA和引导RNA被共同通过显微注射进小鼠的受精卵内。本发明的重度免疫缺陷小鼠，不能产生T，B及NK免疫细胞，从而为人源造血干细胞的移植创造最大的便利条件。

技术领域

本发明涉及一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

人类的免疫应答需要在体内进行，由于受到伦理限制，不能够直接以人为实验对象。啮齿类动物是广泛应用于实验研究的小动物模型，目前免疫系统发育分化及功能研究大多来源于这些模型，但是因为种属特异性的存在，啮齿类动物模型得到的结论并不能直接推导于人类免疫系统。人类的造血免疫功能研究、感染类疾病、自身免疫病以及肿瘤研究都难以实现体内动态观察。一些研究人员则以灵长类动物为替代对象，试图弥补人类与啮齿类动物之间巨大的种属差异，但是因实验对象操作复杂，经济成本高，并不利于推广。黑猩猩、长臂猿等灵长类动物虽然能感染HIV，但是感染后并不发病，而且属濒危动物，逐渐被禁止使用。因此，亟需一种能够应用于人类免疫应答的小动物模型，免疫系统人源化小鼠便应运而生。免疫系统人源化小鼠是指在免疫缺陷小鼠植入人的造血细胞、淋巴细胞或组织而具有人的免疫功能的小鼠模型，为了解人类免疫系统及其免疫应答的重要工具。

由于普通小鼠中存在的免疫细胞会排斥外来移植的人源造血干细胞或淋巴细胞，为了制作免疫系统人源化的小鼠，需要拥有有足够免疫缺陷程度的小鼠。早在1988年，Mccune等发现在重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中植入人胎肝干细胞、胎胸腺和胎淋巴结可以支撑人源T细胞和B细胞的重建。但是由于SCID小鼠较强的NK细胞功能对外源细胞的排斥作用，及随年龄增长出现小鼠T、B细胞，即发生“渗漏现象”等因素，均极大程度的限制了重建。随后通过SCID缺陷小鼠与NOD背景小鼠回交，产生了NOD/SCID小鼠，该小鼠NK细胞活性及天然免疫细胞的功能更低，可以更好地支持重建，所以在接下来的很长一段时间里，NOD/SCID小鼠被认为是用于人源化重建的最理想受者小鼠。然而，当研究者用造血干细胞进行免疫重建时，残存的NK细胞和天然免疫细胞活性，仍然成为了难以跨越的障碍。因此，为了制作更加完善的人源化免疫系统小鼠，需要克服目前免疫缺陷动物中过强的NK细胞功能。而NK细胞发育成熟过程中，IL-2是起到主要作用的细胞因子。对NOD/SCID小鼠的IL-2受体的gamma亚基进行敲除，其体内的T，B和NK细胞基本完全缺失或失去功能，巨噬细胞及DC细胞及补体系统的功能也大幅减弱，且成年后不再会发生免疫渗漏问题，使其成为目前免疫缺陷程度最高的小鼠。且此重度免疫缺陷小鼠寿命比普通NOD/SCID小鼠长30-50％，达1.5-2年，极大的延长了实验的观察期。以上优点，使得此重度免疫缺陷小鼠对人源组织几乎没有排斥反应，使其成为目前最适合作为人源组织/细胞移植的实验动物，包括人源化动物模型(CD34+，BLT及PBLS人源化小鼠)，肿瘤移植及肿瘤干细胞研究(CDX，PDX)，人造血和免疫系统研究和人类感染性疾病(HIV，HBV)的动物模型首选。

如果通过基因敲入的方法，采用人的NGF基因在小鼠基因组中定位替换鼠的NGF基因，可以使人NGF基因在小鼠内源性NGF的表达调控序列控制下表达，在纯化时也不会有鼠源NGF的污染。但是利用常规基因敲入技术获得NGF基因敲入的小鼠存在很多的困难或风险，例如，在基因敲入的过程中需要在ES内发生2次同源重组，经过2次筛选，一次正的筛选，一次负的筛选，才能获得阳性克隆。同源重组载体进入ES细胞内后，可以随机插入小鼠基因组的任何序列，造成假阳性结果，导致小鼠内源性NGF基因不能正确的删除。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，

本发明提供一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于：