[发明专利]一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于：

包括通过CRISPR/CAS9技术敲除小鼠染色体中编码白介素-2受体的gamma链的基因的步骤，

选择白介素-2受体的gamma链的基因的外显子1和2作为敲除位点，

Cas9信使RNA和引导RNA被共同通过显微注射进小鼠的受精卵内。

2.如权利要求1所述的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于：

基因敲除小鼠使用PCR及基因测序进行基因型分析，筛选出目标小鼠。

3.如权利要求3所述的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于：

与正链基因相匹配的引导RNA1序列为:

CGGCTCTCACTAGGGTCAACAGG，

与反链基因相匹配的引导RNA2序列为:

AGCTGGCTACCCACTTGATTGGG。

4.如权利要求1所述的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于：

显微注射流程：

6-1，第一天，选取3-4周龄NOD/SCID雌性小鼠，作为供体，每只小鼠腹腔注射5IU PMSG；47～48小时后，每只小鼠腹腔注射5IU HCG，并与性成熟的正常公鼠合笼交配；

6-2，第二天进行阴道栓检查，并将供体雌鼠拿出用于受精卵采集，同天准备好适龄的代孕母鼠；

6-3，第四天，安乐死供体雌鼠，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶～0.3mg/M2液中，显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，洗涤和采集受精卵，最终将受精卵放在5％CO2，37℃培养箱培养待用；

6-4，第四天，在显微镜下观察，挑选形态正常，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵用于显微注射；

6-5，通过加样器，将混合的Cas9和引导RNA加入到注射针内；安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵；

6-6，200-400倍镜下进行显微注射，将混合的Cas9和引导RNA注射到受精卵细胞质中；注射400枚左右受精卵，注射完毕后，放入5％CO₂，37℃培养箱培/0.5-1h，筛选掉即时死亡的受精卵；

6-7，将受体代孕鼠麻醉，手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口，将注射后的受精卵移植到代孕鼠输卵管内，每只母鼠移植20-30枚注射后受精卵；

6-8，移植完毕后，将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤，将小鼠放到干净的笼盒内，待苏醒后，转移到动物饲养间饲养；

6-9，定期观察手术后代孕鼠的健康和怀孕情况；手术后19～21天母鼠分娩，待幼崽出生2-3周后，剪耳、编号，剪尾，进行PCR和测序鉴定；

6-10，F0小鼠出生后，进行同胞交配，将新生的F1代小鼠剪鼠尾进行裂解后，用引物序列1和引物序列2进行PCR检测。

5.如权利要求4所述的重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法，其特征在于，还包括：

基因鉴定的步骤：

1.样品处理：

1)剪下2-5mm长的鼠尾后保存于离心管中，3000rmp(900g)离心1min，使鼠尾离到管底，

2)每管加入98μLTriton裂解液+2μL的20mg/mL蛋白酶K共100μL的混合物，

3)检查每管内裂解液的量并确保样品淹没在裂解液中，放入烘箱，56℃裂解过夜，

4)98℃加热13min，灭活蛋白酶K，

5)轻弹管底混匀，13000rmp等效16200g离心3min，

6)取2.5μL上清做为模板进行PCR鉴定，

2.PCR产物判断：

1)在PCR产物的电泳条带中，小鼠产物中有680bp片段的，

为IL-Rg敲除成功的小鼠，

2)在敲除成功的小鼠中，还同时有引物序列2的191bp产物片段的，为杂合子小鼠，则剩余小鼠为纯合子。