[发明专利]适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、通用引物及测序方法

说明书

本发明涉及一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、通用引物及基于该建库方法的全长扩增子测序方法。该建库方法针对全长扩增子测序需要进行PCR的特性，结合PacBio测序平台的哑铃型文库接头结构，设计针对全长扩增子的特殊结构的通用引物，并通过扩增反应获得具有特异粘性末端的PCR产物，然后连接具有相同粘性末端的测序接头，完成PacBio测序平台的文库构建。该方法将原有的PacBio标准建库流程优化为仅需一步扩增与酶切连接，极大的简化了全长扩增子的文库构建流程，提升了工作效率，降低测序成本。

技术领域

本发明涉及高通量测序文库构建技术领域，更具体地，涉及一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、所使用的通用引物及基于该建库方法的全长扩增子测序方法。

背景技术

扩增子(amplicon)为DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列。比如通过PCR扩增得到的某个基因的扩增片段，更简单地说，扩增子是经过人工扩增的DNA片段或RNA片段的扩增产物。扩增子测序是一种高靶向性方法，用于分析特定基因组区域中的基因变异。

扩增子测序主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等。16S/18S rDNA包含可变区和保守区，原核微生物的16S rDNA基因长度约为1500bp，真核微生物18S rDNA基因长度约为1500-2000bp。保守区在菌种间差异不大，可反映物种间的亲缘关系，高变区具有属或种的特异性，根据物种亲缘关系不同而有一定的差异。因此16S/18S rDNA成为了国际公认的微生物系统发育和分类鉴定的指标。ITSl是位于真核生物的18S rRNA和5.8S rRNA之间的内转录区域，ITS2位于真核生物的5.8S rRNA和28S rRNA之间的内转录区域。由于进化相对于18S rRNA、5.8S rRNA和28SrRNA迅速而具多态性，因而适合于等级水平较低的系统学研宄。根据保守区序列设计引物，将其扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库的比对，即可确定微生物在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的真菌种类，是目前非常常见的分析真菌方法。

传统16S/18S扩增子测序仅针对16S/18S rDNA的单个或连续的两到三个可变区进行测序与分析，而基于三代测序平台PacBio的全长16S/18S扩增子测序可轻松读取微生物16S/18S rDNA全长序列，突破了二代测序读长较短的局限性，提高了菌株在种水平的分辨能力，真正精确到“种”的分类鉴定。全长扩增子测序获得全部变异区域序列信息不仅能提高物种鉴定的分辨率，还能提高样本中微生物组成鉴定的精确度，从而更加真实的还原样本中微生物的群落结构。

微生物核糖体小亚基SSU rRNA可变区的测序分析方法被广泛应用于环境微生物多样的研究，16S rRNA基因、18S rRNA基因和ITS基因也是进行系统发育和分类研究时最常用的分子标记物。近年来，随着高通量测序技术及数据分析方法的不断进步，大量基于扩增子测序技术的研究在微生物生态学中得到了迅速的发展。但限于Illumina平台的短片段测序长度的限制，基于该平台对部分高变区的测序分析很难将物种精确鉴定到属以下的分类水平。

基于PacBio SMRT单分子测序技术的超长读长优势，开发了覆盖全长核糖体小亚基16S rRNA基因、18S rRNA基因和ITS基因的高通量测序分析技术，解决了Illumina平台短读长的只能针对部分可变区进行分析的技术难题，在最优成本的基础上，实现了菌群分类的精准鉴定。与此同时，基于CCS Reads的原始错误矫正，可获取精确度在99％以上的全长序列。16S rDNA是编码细菌核糖体小亚基的DNA序列，分子大小约1540bp，由9个可变区和10个保守区交叉排列组成。保守区能反映物种间亲缘关系，可变区在不同菌种间存在差异。根据保守区序列设计引物，将可变区扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库的比对，即可确定微生物在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的细菌种类。研宄表明，V4靶基因区域(约300bp)对微生物进行分类较为准确。

发明内容