[发明专利]适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、通用引物及测序方法

权利要求书

1.一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的通用引物，其特征在于，针对单个样本包括：

(1)上游通用引物，所述上游通用引物包括按照5’至3’的方向依次排列的酶切位点序列、上游标签序列、全长扩增子F端通用引物；

(2)下游通用引物，所述下游通用引物包括按照按照5’至3’的方向依次排列的酶切位点序列、下游标签序列、全长扩增子R端通用引物；

所述全长扩增子F端通用引物与扩增子的目的片段F端结合，所述全长扩增子R端通用引物与扩增子的目的片段R端结合；所述上游标签序列与下游标签序列反向互补。

2.根据权利要求1所述的一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的通用引物，其特征在于，所述酶切位点序列为六碱基或六碱基以上的限制性内切酶酶切序列。

3.根据权利要求1所述的一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的通用引物，其特征在于，所述上游标签序列、下游标签序列用于区分不同的扩增子样本，每个标签为10～30bp的特异核苷酸序列。

4.一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以权利要求1-3任一项所述的用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的通用引物分别扩增对应样本全长目标片段；各个样本对应的标签序列各不相同；各个样本对应引物的酶切位点序列相同；各个样本对应引物的全长扩增子F端通用引物相同、全长扩增子R端通用引物相同；

(2)将步骤(1)获取的若干个样本的扩增产物混样；

(3)混合扩增产物经限制性内切酶酶切获得两端具有特异性粘性末端的酶切产物；所述限制性内切酶为提供权利要求1-3所述酶切位点的酶；

(4)酶切产物连接哑铃型测序接头获得适用于PacBio测序平台的全长扩增子文库；所述哑铃型测序接头包括5’端的粘性末端序列和哑铃型颈环结构的接头序列，所述粘性末端序列与酶切产物的酶切粘性末端序列反向互补，所述哑铃型颈环结构的接头序列与PacBio测序仪适配。

5.根据权利要求4所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，步骤(2)中若干个样本的扩增产物等摩尔混样。

6.根据权利要求4所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，混合扩增产物总量大于或等于2μg。

7.根据权利要求4所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，所述步骤(3)的限制性内切酶为六碱基或六碱基以上的限制性内切酶，且无星号活性。

8.根据权利要求4所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，酶切产物连接测序接头后依次进行外切酶消化、纯化获得适用于PacBio测序平台的全长扩增子文库。

9.根据权利要求4所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，所述方法还包括文库质检以确定文库大小。

10.一种适用于PacBio平台的全长扩增子测序方法，其特征在于，包括采用权利要求4-9任一项所述的建库方法进行全长扩增子建库，然后采用高通量PacBio测序平台进行测序。