[发明专利]重组大肠杆菌工程菌及利用其制备S-腺苷甲硫氨酸的方法

说明书

本发明属于酶工程技术领域，涉及重组大肠杆菌工程菌及利用其制备S‑腺苷甲硫氨酸的方法。所述的重组大肠杆菌工程菌含有重组表达载体，所述的重组表达载体含有表达S‑腺苷甲硫氨酸合成酶的基因和表达ATP合成酶的基因。相比传统的发酵法和体外酶催化合成方法，利用本发明的重组大肠杆菌工程菌及利用其制备S‑腺苷甲硫氨酸的方法，能够更简单、更低成本、高产率的制备S‑腺苷甲硫氨酸。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，涉及重组大肠杆菌工程菌及利用其制备S-腺苷甲硫氨酸的方法。

背景技术

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，简称SAM)作为生物体代谢过程的重要中间产物，存在于所有活细胞中，具有转甲基、转硫、转氨丙基作用。SAM是双手性物质，有2种异构体：(R，S)-SAM和(S，S)-SAM，只有(S，S)-SAM才具有生物活性。临床上SAM具有极高的药用价值，主要用于治疗肝内胆汁淤积，还可用于治疗病毒性肝炎、酒精性肝病，改善肝脏功能，缓解抑郁症患者的抑郁症状(具有抗抑郁作用)等。SAM还可与L-多巴联用于治疗帕金森氏病，能提高L-多巴疗效和降低副作用。SAM的市售产品如思美泰。

在生物体内，SAM是由S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-Adenosylmethioninesynthetase，EC 2.5.1.6)催化腺苷三磷酸(ATP)和甲硫氨酸(Met)反应合成，原理见图1。体外S-腺苷甲硫氨酸的制备主要有三种方法：化学合成法、微生物发酵法、酶法催化法。

化学法合成法主要是采用S-同型半胱氨酸和甲基供体合成，存在杂质多、收率低、产物构型复杂等缺陷而未能大规模应用。

微生物发酵法是目前应用最为广泛、成本相对低的一种方法，其主要是利用酵母细胞体内的S-腺苷甲硫氨酸合成酶，通过在培养液中添加前体物质L-甲硫氨酸在酵母细胞体内进行SAM累积合成。该方法的弊端是：SAM积累主要在酵母细胞内，分离纯化过程需要进行细胞壁破碎，工序复杂，同时依然存在着产量低、收率低等问题。

酶法催化法主要是在S-腺苷甲硫氨酸合成酶的催化作用下，利用ATP和L-甲硫氨酸合成SAM。该法主要受限于高催化活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的获得及ATP的高成本(600-700元/kg)，而且在体外催化过程中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶非常不稳定容易失活，因此使得酶法催化合成成本远远高于微生物发酵法，目前还没有该法工业应用的报道。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种重组大肠杆菌工程菌，以能够利用其结合微生物发酵法和酶法催化法各自的优点，避免各自的缺点，更简单、低成本、高产率的制备S-腺苷甲硫氨酸。

为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种重组大肠杆菌工程菌，所述的重组大肠杆菌工程菌含有重组表达载体，所述的重组表达载体含有表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因和表达ATP合成酶的基因。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种重组大肠杆菌工程菌，其中所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶是SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型S-腺苷甲硫氨酸合成酶中突变多个氨基酸位点的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，突变的多个氨基酸位点包括C9R与K224R。

在一种更加优选的实施方案中，本发明提供一种重组大肠杆菌工程菌，其中所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的多个氨基酸突变位点还包括T163S、Q191R、A218T中的一个或多个。

在一种更加优选的实施方案中，本发明提供一种重组大肠杆菌工程菌，其中所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2-8之一所示。