[发明专利]重组大肠杆菌工程菌及利用其制备S-腺苷甲硫氨酸的方法

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述的重组大肠杆菌工程菌含有重组表达载体，所述的重组表达载体含有表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因和表达ATP合成酶的基因，

所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2-8之一所示，

所述的ATP合成酶由腺苷激酶、腺苷酸激酶和多聚磷酸激酶组成。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌工程菌，其特征在于：

所述的大肠杆菌工程菌选自BL21(DE3)、BL21(DE3) pLysS、Rosetta(DE3)、ArcticExpress(DE3)、Origami B(DE3)中的一种；

所述的表达载体是质粒载体，选自pET23b、pET24a、pET28a、pET30a、pET32a、pCDFDuet-1、pET15b、pET21a、pETDuet-1、pACYC184、pTXB1、pTYB21。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述的表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因位于重组质粒载体pET30a内，所述的表达ATP合成酶的基因位于重组质粒载体pCDFDuet-1内。

4.一种利用权利要求1-3之一所述的重组大肠杆菌工程菌制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

（1）发酵所述的重组大肠杆菌工程菌；

（2）发酵后离心收集菌体并用缓冲液重悬菌体；

（3）在菌体重悬液中先加入ATP合成酶催化反应所需的反应物进行反应，再加入S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化反应所需的反应物进行反应。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，在重悬菌体的同时还加入曲拉通X-100和/或EDTA以对菌体进行通透化处理。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，

加入的所述的ATP合成酶催化反应所需的反应物包括腺苷、ATP、ADP、AMP、多聚磷酸盐、镁盐，加入后温度25-30℃、pH 5.0-6.5、搅拌转速150-200r/min下反应30-180min；

加入的所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化反应所需的反应物包括L-甲硫氨酸、镁盐、钾盐、磺酸盐，加入后温度25-30℃、pH 7.5-8.0、搅拌转速150-200r/min下继续反应60-240min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述的腺苷、ATP、ADP、AMP、多聚磷酸盐、镁盐加入后对于OD=20菌体量的浓度分别为50-300mM、1-10mM、10-50mM、10-50mM、500-800mM、5-10mM；

所述的L-甲硫氨酸、镁盐、钾盐、磺酸盐加入后对于OD=20菌体量的浓度分别为200-500mM、100-250mM、50-100mM、300-500mM。