[发明专利]一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法

说明书

本发明涉及一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括步骤如下：嵌合抗原受体慢病毒质粒的构建；慢病毒的制备；原代CD3+T细胞的筛选；原代CD3+T细胞的感染，感染后即得嵌合抗原受体T细胞。本发明中嵌合抗原受体T细胞的制备方法经过优化，省去了T细胞体外活化及扩增培养的步骤，T细胞离体培养时间大大缩短，节省了大量时间，有助于降低T细胞在体外培养污染的可能性，使得嵌合抗原受体T细胞制备过程更加快捷，能够限制T细胞的分化，最大程度发挥嵌合抗原受体T细胞的杀伤作用，本发明制备的嵌合抗原受体T细胞比采用常规方法制备的嵌合抗原受体T细胞杀伤能力更强、治疗效果更佳。

技术领域

本发明涉及一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，属于细胞免疫技术领域。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫治疗已被证实在B细胞恶性肿瘤的患者中有较好的临床疗效。嵌合抗原受体T细胞是从患者血液中提出T细胞，在体外改造细胞使之细胞表面表达嵌合抗原受体，并大量扩增和回输至患者体内。其最终目标是根除癌细胞并提供较长时间的免疫记忆。CAR-T治疗后的患者会有复发的情况出现，其中一个原因为肿瘤微环境会抑制T细胞的增殖和杀伤作用。CAR-T治疗的有效性最重要的一点是CAR-T细胞可以高效的转运/迁移到肿瘤部位，并在肿瘤刺激后具有持续增殖的能力以及强大的杀伤肿瘤的能力。

在利用嵌合抗原受体T细胞进行疾病治疗时，常见的作用靶标包括CD19、CD20和CD30。CD19是大多数B细胞恶性肿瘤表面的标志物，因此以CD19为靶标的CAR-T目前常应用于CD19阳性的复发性B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)和B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的患者。MSKCC(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)和FHCRC(Fred Hutchinson Cancer Research Center)两个机构分别进行了49例和26例成人急性淋巴细胞白血病，有效应答率分别为82.2％和83.3％，取得了良好成效。CD20是一种在大多数B细胞上表达的细胞表面抗原，但在淋巴样干细胞、大多数浆细胞都不表达CD20。CD30是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员。针对CD30的抗体药物结合物brentuximabvedotin(BV)在CD30+淋巴瘤中确实显示出良好的疗效，总应答率为75％，并且完全复发或难治性霍奇金淋巴瘤患者的缓解率为34％。因此CD20和CD30也是淋巴瘤中有效的靶标。

中国专利文献CN109468282A(申请号201811397455.6)公开了一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，该制备方法包括CD19-CAR慢病毒载体的构建，慢病毒的制备，T细胞的分离和培养，T细胞的感染和扩增，病毒感染T细胞后，需培养7-10天，以获得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞。现有技术中CAR-T细胞的制备会将T细胞离体培养2周左右以扩增CAR-T细胞数量来增强疗效，但是，长时间的体外培养会增加CAR-T细胞的分化，降低CAR-T细胞的杀伤能力。目前虽然CAR-T细胞制备方法已经很完善，但想要大规模生产CAR-T细胞，时间短，安全性高就成为CAR-T细胞研究的一个重要方向。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法。本发明的目的在于减少嵌合抗原受体T细胞的体外培养时间，利用低分化的嵌合抗原受体T细胞提高CAR-T细胞治疗的效力，更有效地杀伤肿瘤。

本发明的技术方案如下：

一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括步骤如下：

嵌合抗原受体慢病毒质粒的构建；

慢病毒的制备；

原代CD3+T细胞的筛选；

原代CD3+T细胞的感染，感染后即得嵌合抗原受体T细胞。