[发明专利]一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法

权利要求书

1.一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括步骤如下：

嵌合抗原受体慢病毒质粒的构建；

慢病毒的制备；

原代CD3+T细胞的筛选；

原代CD3+T细胞的感染，感染后即得嵌合抗原受体T细胞；所述感染是将慢病毒与原代CD3+T细胞进行共培养，所述共培养的时间为4～10小时，共培养结束后即得嵌合抗原受体T细胞；

经感染后得到的嵌合抗原受体T细胞直接回输至体内。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述嵌合抗原受体慢病毒质粒是将嵌合抗原受体基因与慢病毒表达载体经双酶切、连接后得到的。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述慢病毒表达载体为pLVX-IRES-Puro质粒或Lenti-EF1-EGFRvIII质粒。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述慢病毒是将嵌合抗原受体慢病毒质粒与辅助质粒混合后转染293ft细胞培养得到的。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述辅助质粒为psPAX2质粒和pMD2.G质粒。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述原代CD3+T细胞是从血液外周血单个核细胞中采用CD3+T细胞分选磁珠筛选得到。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述慢病毒的MOI值为15～25。

8.一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括步骤如下：

(1)全基因合成靶向CD19的嵌合抗原受体基因，所述靶向CD19的嵌合抗原受体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将靶向CD19的嵌合抗原受体基因与慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro质粒经双酶切、连接后得到靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒质粒；

(2)将步骤(1)的靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒质粒与辅助质粒psPAX2质粒、pMD2.G质粒混合后转染293ft细胞培养得到慢病毒；

(3)从血液样本的外周血单个核细胞中采用CD3+T细胞分选磁珠筛选得到原代CD3+T细胞；

(4)将步骤(2)中的慢病毒与步骤(3)的原代CD3+T细胞进行共培养，所述共培养的时间为4～10小时，共培养结束后即得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞；所得嵌合抗原受体T细胞直接回输至体内。

9.一种靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括步骤如下：

1)全基因合成靶向CD20的嵌合抗原受体基因，所述靶向CD20的嵌合抗原受体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，将靶向CD20的嵌合抗原受体基因与慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro质粒经双酶切、连接后得到靶向CD20的嵌合抗原受体慢病毒质粒；

2)将步骤1)的靶向CD20的嵌合抗原受体慢病毒质粒与辅助质粒psPAX2质粒、pMD2.G质粒混合后转染293ft细胞培养得到慢病毒；

3)从血液样本的外周血单个核细胞中采用CD3+T细胞分选磁珠筛选得到原代CD3+T细胞；

4)将步骤2)中的慢病毒与步骤3)的原代CD3+T细胞进行共培养，所述共培养的时间为4～10小时，共培养结束后即得靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞；所得嵌合抗原受体T细胞直接回输至体内。