[发明专利]一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明通过10个不同强度的启动子依次优化三条神经氨酸合成途径中关键酶UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖‑2‑差向异构酶、N‑乙酰氨基葡萄糖‑6‑磷酸异构酶，以及氨基葡萄糖‑6‑磷酸‑N‑乙酰基转移酶、N‑乙酰氨基葡萄糖异构酶和N‑乙酰神经氨酸合酶在基因组上的表达水平，降低了酶的表达对细胞造成的蛋白合成压力，并进一步将三条神经氨酸整合到同一株枯草芽孢杆菌工程菌中，获得了N‑乙酰神经氨酸产量提高的枯草芽孢杆菌，其在摇瓶水平下的产量达到了10.4g/L，为进一步提高枯草芽孢杆菌NeuAc产量奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是一种功能性单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，N-乙酰神经氨酸主要采取天然产物提取法(鸡蛋、燕窝等)，存在其他产物难以分离，且成本较高；另外可以通过全细胞转化的方法获得，但是需要成本较高的底物乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸为底物，导致成本较高。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此以枯草芽孢杆菌为宿主，通过代谢工程改造，以葡萄糖等廉价碳源为底物，高效从头合成神经氨酸是一种有效的策略。

目前在枯草中构建的N-乙酰神经氨酸代谢途径主要通过UDP-N-乙酰氨基葡萄糖为前体的NeuC关键酶合成途径，N-乙酰氨基葡萄糖为前体的Age关键酶合成途径，以及N-乙酰氨基葡萄-6磷酸为前体的NanE关键酶合成途径，由于途径涉及较多外源酶蛋白，同时引入多个酶蛋白容易导致细胞压力，不利于细胞生长和产物合成，因此难以实现多途径复合的策略，这个问题的存在严重限制了神经氨酸产量的提高，进一步限制了其市场应用。

发明内容

为实现三条途径在枯草芽孢杆菌中高效表达，且不造成细胞代谢压力，本发明通过筛选不同强度的启动子对关键代谢途径的基因表达水平进行合理调控，以提高神经氨酸的含量。

本发明的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，利用启动子强化了UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶(NeuC)、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶(NanE)、氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)和N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)的表达；所述启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO.6～15。

在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)来源于脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)。

在一种实施方式中，所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶(NeuC)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶(NanE)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。

在一种实施方式中，采用SEQ ID NO.6～8任一所示的启动子强化氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的表达。