[发明专利]一种纳米开关分子及其控制激活的实体瘤靶向性CAR-T细胞

说明书

本发明公开了一种纳米开关分子及其控制激活的实体瘤靶向性CAR‑T细胞，实体瘤靶向性CAR‑T细胞通过以下步骤制备：1）制备纳米开关分子：采用双乳化‑挥发法使开关分子负载于肿瘤靶向性纳米粒子上；2）构建组装型CAR‑T质粒：用基因重组法将T2A元件、FRB、FKBP序列及靶向实体瘤的ScFv段导入CAR‑T质粒中；3）制备组装型CAR‑T细胞：将组装型CAR‑T质粒转染T淋巴细胞；4）制备实体瘤靶向性CAR‑T细胞：组装型CAR‑T细胞胞吞纳米开关分子。本发明通过使用瘤靶向性纳米粒子负载开关分子，可以使开关分子特异性聚集于肿瘤组织，通过开关分子连接CAR‑T的FKBP和FRAP，使CAR‑T的两部分结合而具有攻击活性，可从根本上解决CAR‑T细胞脱靶效应的问题。

技术领域

本发明属于肿瘤免疫学技术领域，具体涉及一种纳米开关分子及其控制激活的实体瘤靶向性CAR-T细胞。

背景技术

CAR-T疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)在白血病治疗中取得了重大突破，为特定血液肿瘤患者带来了新的希望。但是CAR-T疗法在应用于实体瘤时却面临了阻碍，其中最关键的原因在于目前实体瘤CAR-T的靶点在正常组织中都有少量表达，因此CAR-T可以非特异性攻击正常组织造成严重的脱靶效应，已有相关死亡案例。

CAR-T细胞的制备方法是将CAR基因质粒转染入T淋巴细胞使之成为CAR-T细胞，转染方法包括病毒转染和电穿孔转染法。病毒转染法是用慢病毒或逆转录病毒感染细胞，使之表达相应基因；电穿孔法是用转座子或者转座酶系统对CAR基因进行转染，转座子是一段DNA序列能够通过转座酶切割和插入，CAR基因序列可以插入到质粒的转座子上，质粒在T细胞活化之前电转到T细胞中，之后转座酶切割含有CAR的转座子，然后插入到T细胞的基因组中。使用转座子系统比起电转方式能够改善基因转染的效率，转染效率接近病毒转染。

控制实体瘤CAR-T脱靶效应的主要思路包括：1、寻找新靶点或设计CAR-T细胞的多靶点激活：理想的CAR-T靶点应满足①位于肿瘤细胞表面②在特定肿瘤细胞表面高表达③在正常组织中不表达，但目前尚未找到完全符合上述要求的实体瘤特异性表面抗原；2、控制CAR-T失活，包括导入单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)、Fas胞内结构域(ΔFAS)、iCasp9等人工合成的死亡控制开关，但上述方法均未能从根本上解决CAR-T非特异性激活的问题，并且复杂的CAR-T设计导致为生产制备及大规模临床应用造成了困难。

高分子纳米粒子系指粒径在1-1000nm范围内的高分子粒子，其构成材料为具有生物相容性的高分子材料，可在水溶液中构成稳定的粒径1000nm以下的粒子及负载小分子药物，如脂质体(liposome)、聚乳酸(Poly(lactic acid)，PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)、壳聚糖(chitosan)、环糊精(Cyclodextrin)等，以及上述高分子经其他高分子修饰后形成的复合高分子，如聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)、单甲氧基聚乙二醇(Methoxypolyethylene glycol)和聚N-异丙基丙烯酰胺(poly(N-isopropylacrylamide))等。

开关分子是异二聚体小分子配体，包括赤霉素、雷帕霉素及其衍生物，可连接两个不同结构域使其二聚化以调节生物过程，其中，雷帕霉素衍生物AP21967(A/CHeterodimerizer)有两个结合表面：一个与FKBP12结合，另一个与mTor/FRAP的Frb结构域结合。肿瘤靶向性纳米载体(高分子纳米粒子)可负载开关分子，负载方法包括纳米沉淀法、乳化法、等电点法及药物负载法等，肿瘤靶向性纳米载体包括明胶酶靶向纳米粒子、磁靶向纳米粒子、热靶向纳米粒子和环境响应靶向纳米粒子，其中明胶酶靶向纳米粒子已被前期工作反复证实可以将所负载的药物靶向投递到肿瘤组织。